简介:目的:利用Adeasy-1系统,构建并鉴定CARP基因重组腺病毒载体.方法:PCR扩增含有CARP全长cDNA的片段,经测序验证无误后,亚克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒.经过抗性筛选以及酶切鉴定得到阳性的重组质粒,再在293细胞中进行包装扩增,利用Adeasy系统上的绿色荧光蛋白标签鉴定病毒表达.结果:测序证实PCR产物为CARP全长cDNA;抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;转染293细胞3天后可见绿色荧光,回收病毒可以重复感染293细胞,证明病毒包装成功.
简介:目的探讨MTT法体外药物敏感性试验在胰腺癌化疗药物选择中的作用。方法取156例胰腺癌患者的肿瘤组织进行体外原代细胞培养,以MTF法检测吉西他滨(GEM)、5氟脲嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素(MMC)、奥沙利铂(L—OHP)、伊立替康(CPT-11)、顺铂(DDP)对癌细胞的抑制率。按照实体瘤体外敏感标准,以抑制率〉70%为高度敏感,50%~70%为中度敏感,〈50%为不敏感(耐药)。结果156例胰腺癌标本经病理证实为导管癌135例、腺鳞癌13例、黏液腺癌8例。胰腺导管癌对6种药物均高度敏感;胰腺黏液腺癌和腺鳞癌对5种药物(分别除L.OHP和GPT-11外)高度敏感。GEM对胰腺癌细胞的抑制率高于MMC、L—OHP及CPT-11(P〈0.05),与5-Fu和DDP无显著差异。其他5种药物之间无显著差异。不同类型的胰腺癌细胞对6种化疗药物的敏感性高低排序不同,导管癌对药物敏感性依次为GEM〉DDP〉5-FU〉CPT-11〉MMC〉L—OHP;黏液腺癌为GEM、CPT-11〉DDP、5-FU、MMC〉L—OHP;腺鳞癌依次为L—OHP〉GEM〉5-FU、MMC〉DDP〉CPT-11。结论MTr体外药物敏感性试验有助于胰腺癌化疗药物的正确选择,具有一定临床应用价值。
简介:目的构建分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP)载体毕赤酵母。方法通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α,/pUC18的α因子信号序列处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K,SalI酶切线性化重组质粒αINGAP/pPIC9K。电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,Westernblotting鉴定目的蛋白,ELISA法定量测定其含量。结果重组表达质粒αINGAP/pPIC9K经酶切获得758bp片段,符合α因子与INGAP片段融合的长度,筛选得到3个阳性转化子,培养上清含有与抗INGAP抗体反应的蛋白。结论成功构建了分泌INGAP蛋白的毕赤酵母菌株。
简介:目的构建含Sonichedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体。方法通过BamH1、Xho1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR1及Not1双酶切、T4连接酶连接,将SHH—N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9K-SHH-NDNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定。结果转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致。结论成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体。
简介:目的:探讨纳米碳混悬液在甲状腺手术中对甲状旁腺的保护和应用。方法80例甲状腺肿瘤患者采用随机数字表法随机分为对照组和观察组,观察组术中行腺体内纳米碳注射后行切除术,对照组仅行手术切除,比较2组术后血钙、甲状旁腺素(parathyroidhormone,PTH)的改变情况。结果观察组低血钙发生5例,对照组发生15例,差异有统计学意义(χ2=6.6667,P<0.05);观察组PTH下降5例,对照组发生14例,差异有统计学意义(χ2=5.5910,P<0.05);病理结果证实误切甲状旁腺观察组0例,对照组6例、11枚,差异有统计学意义(χ2=4.5045,P<0.05)。结论纳米碳在甲状腺手术中的应用,有助于甲状腺旁腺的鉴别保护,降低甲状旁腺的损伤。