简介：无

简介：摘要鉴于目前核酸分子检测技术逐步从临床实验室向现场检测转移的发展趋势，急需建立一种高灵敏、高特异、高效和便捷的新型核酸诊断工具来满足临床即时检测（POCT）的需要。基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）的检测方法是一种有前景的新型核酸检测方法。该方法中Cas效应蛋白能够识别高度特异的核酸序列，通过联合高灵敏小型生物传感器运用于POCT，在满足高灵敏性和高特异性的同时具备了检测的高效、便捷的特点。本文综述了近几年基于CRISPR/Cas技术集成小型现场分析传感器相关领域的进展，并讨论了POCT相关检测的研究前景及挑战。

简介：摘要目的利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。

简介：摘要成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）是利用向导RNA（guide RNA，gRNA）引导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的一种基因组定点编辑技术。由于其具有操作简单、特异性高、成本低廉、效率高等特点，一经问世便迅速风靡科研界，成为科学研究的一大利器。随着CRISPR/Cas9技术的不断成熟，其在疾病治疗中的潜力也逐渐被挖掘。本文对CRISPR/Cas9系统的工作原理、在人类疾病治疗中的最新进展和应用前景进行综述，以期为相关基础研究及临床治疗提供新的思路。

简介：摘要成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统，作为原核生物的适应性免疫防御系统，近年来已经被开发成为一种高效的分子诊断工具，其特异、灵敏、快速、便捷等优势使得其在分子诊断领域，尤其是在感染性疾病的诊断上有着极佳的发展前景。本文旨在对CRISPR/Cas系统在感染性疾病诊断的应用现状、优势和局限以及未来的研究方向做一介绍和探讨。

简介：摘要单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是导致人类疱疹性疾病的主要病原体，具有广泛宿主细胞类型、庞大外源基因容量等特点，因此也是一种颇具吸引力的病毒载体。HSV基因组较为庞大，对于病毒基因组的操作技术便成为关键环节。对该病毒基因组的操作先后经历了同源重组(homologous recombination),细菌人工染色体技术(bacterial artificial chromosome, BAC)和CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9 )技术。同源重组具有重组效率低、产物不易纯化等缺点，而且将大型病毒基因组克隆到BAC上是一个耗时耗力的过程。近年来，CRISPR/Cas9技术因其操作简便、重复性好、成本低廉等优势而被越来越多的研究者应用于各种物种的基因工程研究工作中，对于病毒基因组的操作也随之更加精确高效。本文对CRISPR/Cas9技术在HSV基因功能、治疗HSV感染性疾病及HSV载体研究中的应用进行综述，以期对相关的研究工作提供一定参考。

简介：摘要从原核生物的适应性免疫机制衍生出的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein，CRISPR-Cas)系统，以其特异性高、可开发性强、简单高效等特点迅速从众多具有竞争力的基因编辑技术中脱颖而出，既为体内基因编辑技术带来革命性突破，也在体外诊断领域开拓了新的方向。近年来涌现出许多快速、便携、经济、高效的基于CRISPR-Cas系统的体外诊断技术，这些技术在病原体检测方面展示出良好的性能，在肿瘤基因诊断、遗传病筛查、移植排斥反应检测等方面也具有很大潜力。此文仅就CRISPR-Cas系统的作用原理、基于CRISPR-Cas系统的检测方法以及在病原体核酸检测领域的应用进展进行简述。

简介：摘要目的探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）基因敲除的小鼠模型，为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础。方法根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA（guide RNA）并进行筛选，通过PCR扩增出sgRNA（small guide RNA）转录模版，得到4个上游引物。随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选，筛选切割有效的sgRNA，从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验。运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板，接着体外转录Cas9mRNA。将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内，剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定。选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠，结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠，剪取鼠尾组织并测序，最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序，通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合，同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失。结果经PCR扩增得到上游引物sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F与下游引物sgRNAprimer-R。经过sgRNA的体外转录和筛选，sgRNA-1, sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高，被选取用于后续实验。将T7promoter添加到Cas9mRNA的5’端，运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA。把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养。把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部，并成功获得F0代小鼠。通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只。将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后，结合PCR与测序比对，共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只。将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交，得到F2代小鼠。通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察，证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列，电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带，鉴定为纯合子；得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育，结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型。结论成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型，稳定性强，可重复性高，为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础。

简介：摘要人诱导多潜能干细胞（hiPSC）可定向分化为眼特定细胞组织，在视网膜细胞移植、角膜移植、晶状体再生等领域有应用前景；成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白核酸酶（CRISPR/Cas9）基因编辑技术可以高效向hiPSC引入眼遗传病特异突变，将携带眼遗传病基因的hiPSC分化为特定的细胞类型，在体外建立眼遗传病模型或建立体外筛选平台寻找治疗性药物，还可纠正基因组中的遗传突变用于细胞治疗。两者的结合正在为眼再生医学及眼遗传病的基因治疗带来革命性的突破。本文对hiPSC的应用及其与基因编辑技术结合在眼相关遗传病的研究展开综述。（中华眼科杂志，2021，57：712-716）

简介：摘要目的观察microRNA-21（miR-21）敲除对耐伊马替尼的人慢性髓性白血病细胞株K562/G01细胞在增殖、药物敏感性等方面的影响，初步探讨miR-21影响K562/G01细胞伊马替尼敏感性的可能机制。方法运用CRISPR/Cas9技术敲除K562/G01细胞的miR-21，经PCR筛选、Sanger测序鉴定和实时定量PCR检测获得miR-21敲除的单细胞克隆。扩增培养后，采用MTT法、细胞克隆形成实验检测miR-21敲除对K562/G01细胞增殖的影响。使用伊马替尼处理细胞后，用MTT法和Annexin Ⅴ-APC/7-AAD双染流式细胞检测法观察敲除miR-21后K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性的变化。Western blot法检测miR-21敲除前后K562/G01细胞PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、P210BCR-ABL、p-P210BCR-ABL蛋白表达量的变化。结果成功构建了3个miR-21敲除的K562/G01单细胞克隆，CRISPR/Cas9介导的突变效率为7.12%~8.11%。miR-21敲除使K562/G01细胞的增殖受抑，野生型和1#、2#、6#单细胞克隆的克隆形成率依次为（57.67±8.25）%、（26.94±5.36）%、（7.17±2.11）%、（31.50±3.65）%，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-21敲除使K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性增加，野生型和1#、2#、6#单细胞克隆对伊马替尼的IC50值分别为（21.92±1.36）µmol/ml、（3.98±0.39）µmol/ml、（5.38±1.01）µmol/ml、（9.24±1.36）µmol/ml，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-21敲除后，其靶基因PTEN的蛋白表达水平未见明显变化，但PI3K、AKT信号分子的活化受到抑制，并且P210BCR-ABL、p-P210BCR-ABL蛋白表达也下调。结论miR-21敲除抑制K562/G01细胞增殖，提高其对伊马替尼的敏感性，这可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路和BCR-ABL表达实现的。

简介：摘要目的观察microRNA-21（miR-21）敲除对耐伊马替尼的人慢性髓性白血病细胞株K562/G01细胞在增殖、药物敏感性等方面的影响，初步探讨miR-21影响K562/G01细胞伊马替尼敏感性的可能机制。方法运用CRISPR/Cas9技术敲除K562/G01细胞的miR-21，经PCR筛选、Sanger测序鉴定和实时定量PCR检测获得miR-21敲除的单细胞克隆。扩增培养后，采用MTT法、细胞克隆形成实验检测miR-21敲除对K562/G01细胞增殖的影响。使用伊马替尼处理细胞后，用MTT法和Annexin Ⅴ-APC/7-AAD双染流式细胞检测法观察敲除miR-21后K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性的变化。Western blot法检测miR-21敲除前后K562/G01细胞PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、P210BCR-ABL、p-P210BCR-ABL蛋白表达量的变化。结果成功构建了3个miR-21敲除的K562/G01单细胞克隆，CRISPR/Cas9介导的突变效率为7.12%~8.11%。miR-21敲除使K562/G01细胞的增殖受抑，野生型和1#、2#、6#单细胞克隆的克隆形成率依次为（57.67±8.25）%、（26.94±5.36）%、（7.17±2.11）%、（31.50±3.65）%，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-21敲除使K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性增加，野生型和1#、2#、6#单细胞克隆对伊马替尼的IC50值分别为（21.92±1.36）µmol/ml、（3.98±0.39）µmol/ml、（5.38±1.01）µmol/ml、（9.24±1.36）µmol/ml，差异有统计学意义（P<0.05）。miR-21敲除后，其靶基因PTEN的蛋白表达水平未见明显变化，但PI3K、AKT信号分子的活化受到抑制，并且P210BCR-ABL、p-P210BCR-ABL蛋白表达也下调。结论miR-21敲除抑制K562/G01细胞增殖，提高其对伊马替尼的敏感性，这可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路和BCR-ABL表达实现的。

简介：摘要 作为化学学科一大独有的特色标志，化学方程式既是化学教学的重头戏也是化学教学的拦路虎。一方面，化学方程式是化学教学中的一个重要部分，化学中化学反应的表示、反应原理的解释以及物质的化学性质说明都离不开化学方程式，它是学生学好化学形成正确的科学思想和积极的学习态度的重要基础；另一方面，同时亦是化学教学中的难点之一，学生往往在学习化学方程式时采用死记硬背的方法，加之不能清楚地理解化学方程式所要表达出来的微观结构蕴意，使得初三学生在初接触化学学科时困难重重，学习兴趣降低，对接下来的化学学习造成了负面的影响。本文主要采用文献法和个案研究法，通过阅读大量的参考文献，阐述化学方程式的含义，强调化学方程式的基础性和重要性；在此基础上，学习与分析有关化学方程式的教学案例，从中领悟总结出适合中学生学习化学方程式的方法。

简介：摘要目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。结果H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。结论成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。

简介：摘要：“CAS 5D跨学科整合”智慧课程体系，是将语文、音乐、美术、科学四门学科相互整合贯通，进行组块教学的课程实践研究。力求形成一种以丰富学生文科思维，培养创新精神，提升美育鉴赏力的新型授课模式，并希望以此类融合课程点亮学生发现美的眼睛，使之成为更美好的人。

简介：摘要：本文简述了某核电13周计划运作特点，分析了13周计划的工作过程管理模式，并提出了后续13周计划管理优化思路，为核电生产管理提升提供参考。

简介：摘要近年来细菌的耐药问题日益严重，其形成生物膜后更是具有极强的耐药能力，治疗难度极大提高。除屏障作用、微环境改变等理化因素外，生物膜中部分基因调控也特异地提高细菌耐药性。细菌耐药与形成生物膜的能力之间可能存在共同的调控机制。Ⅰ型成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统能够调节细菌耐药基因的获得和传播，其作用因种属、进化过程、环境压力而异。新近有报道Ⅰ型CRISPR系统影响生物膜的形成，而且参与噬菌体和生物膜的相互作用，有可能成为研究噬菌体治疗的切入点。本文对近年来细菌耐药形势、生物膜耐药新进展，以及Ⅰ型CRISPR系统影响细菌生物膜的形成与耐药的生物学意义进行综述，为防治细菌感染提供新思路。

简介：

简介：摘要目的探讨弯刀综合征的临床表现、诊断、治疗和预后。方法收集2013年1月至2020年11月广东省人民医院超声心动图诊断后经手术、心脏CT或心导管检查证实的13例弯刀综合征患儿的临床表现、X线胸片、超声心动图、心脏CT及心导管检查、手术方法、预后和随访资料。结果13例患儿中男7例，女6例。年龄21天~10岁，平均17个月。体质量3.2~29.5 kg，平均7.9 kg。婴儿型10例，临床表现为反复呼吸道感染、心力衰竭、生长发育迟缓，其中8例合并重度肺动脉高压。成人型3例，均因发现心脏杂音检查确诊。合并心脏畸形包括房间隔缺损12例，动脉导管未闭2例，右心室双出口/室间隔缺损1例，右肺及右肺动脉发育不良4例，右肺发育不良2例，侧支循环供应右肺6例。10例行右肺静脉异位引流矫治术，1例仅行右心室双出口矫治术，其中3例术后因严重肺动脉高压死亡；1例因梗阻型肺动脉高压失去手术机会，1例因合并神经系统病变放弃治疗。出院时1例出现右肺静脉狭窄，血流速度2 m/s。随访8例患儿，最长7年7个月。随访期间2例出现右肺静脉狭窄，血流速度分别为1.8 m/s、2.4 m/s。结论如发现中位心或右位心，反复呼吸道感染，不明原因的肺动脉高压，需考虑弯刀综合征的可能。可联合超声心动图及心脏CTA尽早明确诊断。婴儿型、术前肺动脉高压重度是弯刀综合征的死亡危险因素。术后仍需长期终身的随访，必要时需再次手术干预。

简介：摘要目的总结儿童鼻神经胶质异位的临床特点及诊疗经验。方法回顾性分析2014年8月至2019年10月北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科收治的13例儿童鼻神经胶质异位患儿的临床资料，其中男童9例，女童4例，月龄1~38个月，中位月龄5个月。全部患儿术前均行影像学检查，对全部鼻外型及混合型病变均进行B超及MRI检查，对鼻内型病变进行鼻窦薄层低辐射CT及MRI检查。根据病变部位及影像学检查提示的病变范围采取鼻外入路或经鼻内镜手术治疗。所有患儿均接受全身麻醉下鼻神经胶质异位切除术。术后定期随访，对手术效果进行评估。采用描述性统计学方法分析其主要临床表现、病变部位、影像学结果、手术入路及随访结果。结果13例患儿病变分为鼻内型（8例）、鼻外型（3例）及混合型（2例）。主要临床表现为单侧鼻腔阻塞（8例）和鼻背类圆形包块（5例）。病变部位包括鼻背（5例）、鼻腔外侧壁中鼻甲前端（5例）及嗅裂（3例）。手术入路包括鼻外入路（5例）和经鼻内镜（8例），全部患儿手术顺利，术中无并发症出现。术后随访3~65个月，全部病变未见复发。结论儿童鼻神经胶质异位临床罕见，临床表现缺乏特异性。术前CT及MRI检查有助于评估病变的部位、范围，并指导手术治疗。主要治疗方式为手术彻底切除。

简介：摘要随着生产工艺、工作环境的改善及个体防护的提升,因吸入毒气或毒液所导致的化学性肺炎已少有发生。我们对13名工人在清理磷矿渣过程中引起的吸入性化学性肺损伤的现场流行病学资料及临床资料进行分析，患者出现肺部感染征象，排除新型冠状病毒肺炎后，经抗感染、足量激素和止咳化痰等对症支持治疗后病情好转，1月后复查10例患者病灶吸收，3例患者遗留肺纤维化病灶。