简介:摘要成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白基因(CRISPR/Cas)系统,作为一种新兴的基因编辑系统,根据Cas蛋白的数量可分为一类系统和二类系统。二类系统中的CRISPR/Cas9仅借助Cas9蛋白和单链向导RNA即可对目标核酸进行切割,是目前应用最为广泛的CRISPR/Cas系统。除了基因编辑在遗传病治疗中的应用,CRISPR/Cas系统衍生出的多种技术在疾病相关基因的筛查、基因表达调控、病原微生物的快速检测和防治等领域也展现了巨大的应用前景。本文就CRISPR/Cas系统的发现历程及其衍生的几个主要技术的应用进行总结,旨在为生命科学领域研究人员提供参考。
简介:摘要作为新一代的基因编辑技术,规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins,CRISPR/Cas)系统具有强大的基因编辑功能,已被应用于许多领域。目前,已开发的规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein, Cas)9、Cas12、Cas13和Cas14检测系统被广泛应用于传染病病原体的核酸检测,具有检测成本低、操作简单、灵敏度高等优点。本研究介绍了CRISPR/Cas系统的发展史、作用机制,以及几种Cas蛋白在传染病相关病原核酸检测中的应用。
简介:摘要目的研究甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)位点多态性及地区分布。方法选取1962-2014年分离的203株鼠疫菌,培养并提取DNA。采用3对CRISPR引物对菌株DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行测序。根据菌株CRISPR位点的间区序列种类和排列情况,确定菌株的基因型(类群),采用BioNumerics 5.10软件进行聚类分析。结果203株鼠疫菌发现有16种间区序列,包括YPa位点9种、YPb位点4种、YPc位点3种,发现新的间区序列a1′。共发现5个CRISPR基因簇,分别为Cb2、Ca7、Ca7′、CaΔ5′、Ca35′。不同的基因簇呈现区域性特征:Cb2主要分布在会宁县、平川区,Ca7主要分布阿克塞哈萨克族自治县;Ca7′主要分布在夏河县;Ca35′主要分布肃北蒙古族自治县、玉门市;CaΔ5′主要集中在肃南裕固族自治县。结论CRISPR分子分型方法能够较好地区分甘肃省不同疫源地的菌株,且各基因簇呈现一定的区域性特征。对研究甘肃省鼠疫菌进化规律和人间疫情分子生物学溯源有一定意义。
简介:摘要目的应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型,设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3,制备AAV,病毒滴度达1~4×1013 GC/ml;感染WD肝细胞,72 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出其中活性最高者sgRNA1,构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT,应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞,测序和T7E1酶切检测模板修复效率;用HT特异性引物行PCR,验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。结果Sanger测序结果显示,sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%],与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%],差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用HT进行基因修正,能检出特异性修正后的ATP7B基因;二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。结论AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。
简介:摘要目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。
简介:摘要病理诊断向来就是诊断疾病的"金标准",正确的病理诊断有助于临床治疗方案的制定和预后的判断。然而由于临床病理诊断工作非常繁杂,偶有不慎,可能会出现标本缺失、张冠李戴、蜡块内混入其他组织等病理技术上的差错。法医物证中的个体识别除了广泛用于灾难事故、交通事故和失踪人口的身份认定、刑事案件中对犯罪嫌疑人的同一认定外,还可以应用于医疗卫生领域,如医源性的病理切片、蜡块的同一认定,肿瘤组织来源的确认,造血干细胞移植前后供体与受体的基因型比对等。该文就其中心鉴定的3个案例做一分析,并谈谈如何利用短串联重复序列(STR)分型图谱甄别正确的组织病理标本。
简介:摘要成簇癫痫发作是癫痫患者尤其是耐药性癫痫患者中常见的临床现象,与患者平常的发作频率、持续时间、发作类型等不同,其发作后精神障碍、癫痫持续状态和病死率较一般癫痫发作高,严重影响癫痫患者及护理人员的生活质量。目前关于成簇癫痫发作的发病机制、诊断标准及治疗原则尚不明确。本文以“seizure cluster”“acute repitetive seizures”及“成簇癫痫发作”作为关键词,检索“Pubmed”“万方医学”及“中国知网”数据库1990—2019年的相关文献,对目前关于成簇发作的定义、患病率、危险因素、癫痫灶定位、潜在机制及目前的治疗意见等做一综述,以期医护人员更清晰地认识及科学地处理成簇癫痫发作,降低成簇癫痫发作患者癫痫持续状态及其他严重并发症的发生率,提高患者及护理人员的整体生活质量。
简介:摘要目的联合应用基因组拷贝数测序(copy number variation sequencing,CNV-seq)和短串联重复序列(short tandem repeats,STR)技术分析染色体异常高危孕妇的流产原因和产前诊断方法。方法共收集36份样本,类型包括羊水、流产组织、全血、绒毛和脐带血。运用CNV-seq和STR分析,检测亚显微结构微缺失、微重复,染色体非整倍体性改变、染色体嵌合及三倍体。结果在完成检测的样本中,1份样本检出4p15.1p16.3和14q11.1q22.1重复,1份检出19p13.3缺失,8份检出染色体非整倍体,4份检出染色体嵌合,2份检出三倍体,20份样本未检出明确的致病性CNV,检出率为44.44%。结论CNV-seq作为一种高通量检测技术,具有快速、简便、准确率高等优点,与STR分析联合使用适用于产前诊断和流产因素分析。