体外真菌(1-3)-β-D葡聚糖检测影响因素探讨

成春岚1向成玉（通讯作者）2朱巧英1陈曦3石

（2西南医科大学附属医院检验科四川泸州646000）

（3四川省妇幼保健院功能影像科四川成都610045）

【摘要】目的：探讨真菌细胞壁（1-3）-β-D葡聚糖体外检测的影响因素。方法：实验组：将白色假丝酵母菌分别用正常血浆、无热原蒸馏水、0.9%的生理盐水、0.02%两性霉素B生理盐水和0.75%氟康唑生理盐水稀释为0.05麦氏单位（含白色假丝酵母菌1×107CFU/ml）,对照组：将上述各液稀释100倍，采用免疫沉淀试验（G试验）检测其10次（1-3）-β-D葡聚糖含量，并进行体外培养，以此探讨生理盐水、抗真菌药物对（1-3）-β-D葡聚糖体外检测的影响。结果：实验组中，正常血浆葡聚糖含量为（92.5±14.2）ug/L，蒸馏水组含量为（94.5±15.2）ug/L，生理盐水组含量为为（93.6±14.8）ug/L，两性霉素B组含量为（95.5±16.2）ug/L,氟康唑组（97.3±16.8）ug/L,经统计检验组内结果间无显著性差异（P＞0.05）。对照组中：正常血浆含量为（6.8土2.7）ug/L，蒸馏水组含量为（6.1±2.4）ug/L，生理盐水组含量为为（7.3±2.0）ug/L，两性霉素B含量为（6.8±2.5）ug/L,氟康唑组（6.7±2.8）ug/L,经统计检验组内间结果无显著性差异（P＞0.05）。实验组与对照组比较有显著差异（P＜0.05）。结论:体外真菌细胞壁（1-3）-β-D葡聚糖含量变化与液体介质无关，与真菌治疗药物无关，与真菌数量密切相关。

【关键词】（1-3）-β-D葡聚糖；体外检测；两性霉素B氟康唑

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）16-0043-02

【Abstract】ObjectiveTostudytheinfluencefactorsofthedetectionoffungalcellwall1,3-β-D-glucaninvirto.MethodsTheexperimentalgroup:theCandidaalbicansweredilutedwithnormalplasma,Pyrogen-freedistilledwater,0.9%ofphysiologicalsaline,0.02%amphotericinBsaline,and0.75%fluconazolesalineas0.05McIntoshunit(containingcandidaalbicans1×107CFU/ml).Thecontrolgroup:dilutingtheprecursorysolutionsto100times.Measuringtheconcentrationof1,3-β-D-glucaninthesolutions10timesthroughGtest,andculturingtheCandidaalbicansineachsolutioninvirtotostudytheinfluenceofantifungaldrugs,physiologicalsalineonthetestingof1,3-β-D-glucaninvitro.ResultsTheexperimentalgroup:theconcentrationof1,3-β-D-glucaninnormalplasma,Pyrogen-freedistilledwater,0.9%ofphysiologicalsaline,0.02%amphotericinBsaline,and0.75%fluconazolesalinewere(92.5±14.2)ug/L，(94.5±15.2)ug/L,(93.6±14.8)ug/L，(95.5±16.2)ug/L,and(97.3±16.8)ug/L.Thedifferencesinthegrouparenotsignificantbystatisticstest(P>0.05).Thecontrolgroup:theconcentrationof1,3-β-D-glucaninnormalplasma,Pyrogen-freedistilledwater,0.9%ofphysiologicalsaline,0.02%amphotericinBsaline,and0.75%fluconazolesalinewere(92.5±14.2)ug/L，(94.5±15.2)ug/L，(93.6±14.8)ug/L，(95.5±16.2)ug/L,and(97.3±16.8)ug/L.Thedifferencesinthegrouparenotsignificantbystatisticstest(P>0.05).Thereweresignificantdifferencesbetweentheexperimentalgroupandthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionTheconcentrationofFungal1,3-β-D-glucaninvirtohasnotingtodowithliquidmediumsorantifungaldrugs,butiscloselyrelatedtothenumberoffungi.

【Keywords】1,3-β-D-glucan;Detectioninvirto;AmphotericinB;Fluconazole

真菌(1-3)-β-D葡聚糖的检测是诊断深部真菌感染的快速准确的方法，其特异性和敏感性已经得到一致的公认[1.2.3.4.5]。但是据报道生物大分子和头孢菌素等对检测结果有影响[3.4.5]，常常出现假阳性、假阴性结果。为了观察体外检测过程中是否受到常见介质的影响。我们选择了正常血浆、无热原蒸馏水、0.9%的生理盐水、0.02%两性霉素B生理盐水和0.75%氟康唑生理盐水对白色念珠菌进行稀释，以观察治疗用药两性霉素B和氟康唑对体外检测结果的影响。现将结果报告如下。

1.材料与方法

1.1仪器与试剂

MD-80型微生物动态快速检测系统，T01智能恒温仪，冰浴槽以及GKT109动态真菌检测试剂盒(定量),均由北京金山川科技发展公司提供。

1.2待测液制备

将白色假丝酵母菌用正常血浆、无热原蒸馏水、0.9%的生理盐水、0.02%两性霉素B生理盐水和0.75%氟康唑生理盐水稀释为0.05麦氏单位（含白色念珠菌1×107CFU/ml）。取上述制备好的各样本100ul，加入样品处理液中混匀后70℃保温10分钟取出后立刻放入冰水浴中即为待测样品。细菌培养取每种液体10ul倾注于平板接种，根据生长的菌落进行计算。

1.3测定分析

取待测样品200ul直接加入反应主剂中，溶解后使用微量加样器转移至10×75mm标准玻璃反应管中（操作规程中不要产生气泡），插入MD-80微生物快速动态测定系统中进行反应，反应结束后由标准曲线自动计算出待测血浆中葡聚糖含量。操作过程中注意避免微生物及细菌污染。

1.4统计分析

测定结果用SPSS统计软件t检验进行分析,(1-3)-β-D葡聚糖含量以均数±标准差表示，P＜0.05为差异有显著性意义。

2.结果

实验组白色假丝酵母菌菌落数大于10万CFU/L，葡聚糖含量为93.8±15.8ug/L，对照组白色假丝酵母菌菌落数为2000CFU/L，葡聚糖含量为7.1±2.5ug/L,经spss统计软件t检验，组内结果无显著性差异（P＞0.05），组间结果有显著性差异（P＜0.05）。结果见附表。

表1两组(1-3)-β-D葡聚糖浓度（ug/L）

※组内比较结果无显著差异（P＞0.05），▲组间比较结果有显著差异（P＜0.05）。

3.讨论

（1-3）-β-D葡聚糖是一种多糖，普遍存在于除接合菌外的真菌细胞壁中，占真菌细胞壁干重的50％以上，尤其在酵母样真菌中含量最高[1]，其他微生物如细菌、病毒及动物、人体细胞均缺乏此成分。因此，血浆（1-3）-β-D葡聚糖检测对真菌深部感染早期诊断具有重要意义[1.2.3.4.5]。

某些情况可干扰检测结果而出现假阳性，如标本污染等。本研究中所需器皿均行灭菌、去热源处理，操作中坚持无菌原则，所选病例均排除了干扰因素，检测结果可靠。

为了观察体外其他因素对结果的影响，我们对检测介质进行研究，所选几种介质除抗真菌药外，基本为实验时常用的介质，结果发现：实验组、对照组内葡聚糖体外检测无显著差异，表明检测结果与液体介质无关；特别是在真菌治疗过程中使用两性霉素和氟康唑很普遍，但本研究未发现治疗用两性霉素和氟康唑对结果有异常的影响。组间结果差异有显著性，表明与菌落数显著相关，说明一定浓度的真菌溶液葡聚糖含量才足够检出。当溶液中含有的真菌小于10000个菌落数时，体外检测其葡聚糖含量不能测出，说明这一计量真菌溶液葡聚糖含量还达不到体外检测检出水平。至于是否能引起感染，尚需动物实验进一步证明。这需要下一步实验来研究。

【参考文献】

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