简介:摘要目的应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型,设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3,制备AAV,病毒滴度达1~4×1013 GC/ml;感染WD肝细胞,72 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出其中活性最高者sgRNA1,构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT,应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞,测序和T7E1酶切检测模板修复效率;用HT特异性引物行PCR,验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。结果Sanger测序结果显示,sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%],与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%],差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用HT进行基因修正,能检出特异性修正后的ATP7B基因;二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。结论AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。
简介:摘要目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。
简介:摘要目的宏观了解2019年中国肿瘤药物临床试验开展及抗肿瘤药物上市情况。方法自中国国家食品药品监督管理总局药物临床试验登记与信息公示平台登记数据库提取2019年登记的肿瘤药物临床试验和相关试验药品信息,从中国国家药品监督管理局国产药品及进口药品数据查询系统收集2019年抗肿瘤药物的上市信息,汇总分析肿瘤药物临床试验的数量、试验分期、试验范围、适应证、药物类型、作用机制等以及上市肿瘤药物情况。结果2019年中国共登记了474项肿瘤药物临床试验,占同期全部药物临床试验的21.8%,其中由国内制药企业发起397项(83.8%),国际多中心试验62项(13.1%),Ⅰ期临床试验所占比例(47.3%)最高。国内制药企业发起的国际多中心试验所占比例为4.8%,低于全球制药企业(55.8%,P<0.001),Ⅰ期临床试验和等效性试验所占比例(51.9%和19.4%)高于全球制药企业(23.4%和1.3%, P<0.001)。肿瘤药物临床试验共涉及27种肿瘤,肺癌、实体瘤、乳腺癌为最常见的适应证,分别有103、95和49项相关药物临床试验。我国三大特色肿瘤——胃癌、肝癌和食管癌的相关药物临床试验共计47项。临床试验共涉及335种肿瘤试验药物,其中288种(86.0%)由国内制药企业开发,47种(14.0%)由全球制药企业开发。药物类型以原研药为主,原研药占72.2%(242/335);药物作用以治疗为主,肿瘤治疗药占89.6%(300/335);作用机制以靶向治疗和免疫治疗为主,分别占74.6%(250/335)和20.3%(68/335)。国内制药企业开发的药物中,原研药占68.4%,低于全球制药企业的95.7%,差异有统计学意义(P<0.001)。2019年,有针对11种肿瘤的17种抗肿瘤药物在中国获批上市。结论中国肿瘤药物临床试验已进入蓬勃发展时期,以靶向药和免疫药为代表的大量创新药物进入试验及临床,本土制药企业已成为肿瘤药物研发的重要力量。针对中国高发肿瘤加强药物研发是未来的重点工作方向。