尼麦角林的微生物限度检查方法学验证

王世峰 符兴远

摘要：目的：建立尼麦角林的微生物限度检测方法。方法：按照《中国药典》2020版通则1105、1106，通过加入中和剂，采用薄膜过滤法，用pH值7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗过滤，通过3次独立的平行试验,分别计算各试验菌每次试验的回收率并对控制菌的检查法进行适用性试验,确定适宜的微生物限度检查方法。结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率在50%～200%之间，大肠埃希菌(控制菌检查)适用性试验满足要求。结论：此方法有效地解决了尼麦角林原料非水溶性致前处理困难的问题，并有效的消除本品微生物限度检查内在干扰物的抑菌活性，可用于尼麦角林微生物限度计数和控制菌检测。

关键词：微生物限度；尼麦角林；适用性试验；薄膜过滤法

引言

微生物限度检查法系指检查菌规定制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数、霉菌数和酵母菌总数、控制菌检查[1]。尼麦角林是意大利爱宝药厂开发的半合成的麦角碱类衍生物，有a受体阻断作用和扩血管作用，可加强脑细胞能量的新陈代谢，增加氧和葡萄糖的利用，促进神经递质多巴胺的转换而增强神经传导，加强脑部蛋白质生物合成，改善脑功能。尼麦角林片的适应症为适用于急、慢性血管性或代谢性脑功能不全(脑动脉硬化、脑血栓和栓塞、短暂性脑缺血发作), 目前上市的剂型有片剂、胶囊、注射剂等， 现已在全世界广泛应用于老年人认知、情感及行为障碍的临床治疗[2]。尼麦角林原料是一种是淡黄色结晶性粉末，其稳定性差，在乙醇和丙酮中易溶,在水中不溶。供试品采用加大稀释倍数，加入中和剂(5%聚山梨酯80作为助溶剂、氯化钙作为消除酮羰基形成螯合物干扰与甘氨酸作为消除麦角碱类衍生物酸碱中和及酮类化合物干扰)，薄膜过滤法三者结合对其中和后进行微生物限度计数、控制菌检查方法适用性试验，证实采用的方法可有效解决其非水溶性处理难等问题及排除其他因素导致的抑菌性，计数方法适用性回收率在50%～200%范围内，控制菌(大肠埃希菌)适用性试验满足要求。

1、实验部分

1.1仪器

SW-CJ-2FD-II洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；YXQ-LB-50SII高压蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器厂)；ACS-1电子天平(中山市恒新电子有限公司)；SHH-400L生化培养箱(重庆康城永生试验设备有限公司)；BCD-166WM冰箱(美的)

1.2药品

尼麦角林(批号：80312107002，海南赛立克药业有限公司)。

1.3试验菌种

金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、铜绿假单胞菌［CMCC(B) 10 104］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］、大肠埃希菌［CMCC(B)44 102］。购于中国食品药品检定研究院，传代为第2代，工作用菌为第3代。注：下列正文中菌种名称采用菌种编号代替。

1.4培养基与试剂

胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB)、麦康凯液体培养基(MCB)、麦康凯琼脂培养基(MCA)、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(SCP)以上干粉培养基均购于广东环凯微生物科技有限公司；下列正文中培养基名称采用培养基通用缩写代替。

1.5菌液、培养基、溶液制备

将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和大肠埃希菌制备参照《中国药典》2020 版通则1105、1106“菌种及菌液制备”进行新鲜浓菌液的制备。将浓菌液逐步进行稀释，使其最后的菌液计数结果不大于100cfu/mL，菌液在2～8  ℃保存，在24h内有效。

培养基的制备参照说明书进行配制与灭菌，按照《中国药典》2020版通则1105项下“表1 试验菌液的制备和使用”中的“计数培养基适用性检查”规定，接种不大于100cfu的菌液至TSB或TSA平板或SDA 平板中；用相应的对照培养基替代被检培养基进行同法操作。将所有培养物在表1规定条件下培养，每天计数，计数结束后把被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在50%～200%范围内，表示结果满足要求，该培养基可在进行后续试验中使用无菌5%聚山梨酯80溶液配制方法：称取5g聚山梨酯80，加纯化水溶解并定量稀释成100mL，过滤，去除杂质，置100 mL 具塞瓶中，121℃湿热灭菌30 min，冷却备用。

无菌10%氯化钙溶液配制方法：称取10g氯化钙，加100mL纯化水使溶解，过滤，去除杂质，置100 mL 具塞瓶中，121  ℃湿热灭菌30min，冷却备用。

无菌10%甘氨酸溶液配制方法：称取10g甘氨酸，加100mL纯化水使溶解，过滤，去除杂质，置100 mL 具塞瓶中，121  ℃湿热灭菌30 min，冷却备用。

1.6供试液的制备

(1) 中和剂溶液制备：分别取100mL含5%聚山梨酯80的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、100mL 10%无菌氯化钙溶液和100mL 10%无菌甘氨酸与无菌锥形瓶中，混匀。

(2)供试液制备称取尼麦角林供试品5g，加入到250mLSCP中，混匀，作为1：50供试液；向供试液中加入150mL中和剂溶液，混匀，作为1:80供试液。

2结果与讨论

2.1微生物限度计数方法适用性试验

2.1.1试验样品溶液的制备

(1)试验组：取5支无菌试管，分别加入供试液9.9mL，再分别加入表1中菌液0.1mL(含菌量为500～1000cfu)，混匀待用(每1mL供试液中含不大于100cfu菌量)。

(2)供试品对照组：取1支无菌试管，加入供试液9.9mL和0.1mLSCP，混匀待用。

(3)菌液对照组：取5支无菌试管，分别加入SCP 9.9mL，再分别加入表1中菌液0.1mL(含菌量为500～1000cfu)，混匀待用(每1mL缓冲液中含不大于100cfu菌量)。

(4)中和剂对照组：取5支无菌试管，分别加入0.5g/mL硫酸镁溶液9.9mL，再分别加入表1中菌液0.1mL(含菌量为500～1000cfu)，混匀待用(每1mL 溶液中含不大于100cfu菌量)。

(5)阴性对照组：取SCP 1mL注入薄膜过滤器的滤膜上，同法操作。

(7)回收率计算公式：

供试品组回收率%=（试验组菌落数-供试品组菌落数）/菌液对照组菌落数×100%。(1)

中和剂对照组回收率%=中和剂对照组菌落数/菌液对照组菌落数×100%。(2)

2.1.2检测

(1)操作步骤：在薄膜过滤器上放置孔径为0.45  μm的无菌滤膜，扣入无菌滤杯，在无菌滤杯中加入10mLSCP润湿滤膜，滤过。分别取上述溶液1mL注入滤膜上，用SCP冲洗，每次冲洗量为100mL，分别冲洗8次，过滤后，取出滤膜，菌面朝上贴于TSA平板和SDA平板上，每种菌平行制备两个平皿，倒置在培养箱中培养。

(2)培养基和培养条件

   ①TSA培养时间：CMCC(B)26003、CMCC(B)

10104、CMCC(B)63501菌株在30～35  ℃培养时间不超过3d，CMCC(F)98001、CMCC(F)98003菌株在30～35℃培养时间不超过5d。

②SDA培养时间：CMCC(F)98001、CMCC(F)98003菌株在20～25℃培养时间不超过5d。

2.1.3结果要求

结果判定：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在50%～200%范围内，中和剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应在50%～200%范围内，阴性对照组应无菌落生长。

试验结果：从实验结果如表1、2及图1和图2所示。可以看出，冲洗量达800mL，三次独立平行试验中试验组的菌落数减去供试品组的菌落数与菌液组的菌落数的比值均在50%～200%范围内, 中和剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应在50%～200%范围内，阴性对照组应无菌落生长，结果表明本建立的的计数方法符合中国药典的要求。

2.2控制菌检查方法的适用性试验

2.2.1增菌培养

(1) 试验组：取供试液100mL于薄膜过滤器的滤膜上，滤过，用SCP冲洗，每次冲洗量为100mL，分别冲洗8次，在最后一次冲洗液中加入1mL 不大于100cfu的大肠埃希菌菌液，过滤，取出滤膜，接种至200mLTSB培养基中，置培养箱(30～35℃)中培养18～24h。

(2)阳性对照组：取SCP 100mL注入薄膜过滤器的滤膜上，加入1mL不大于100cfu的大肠埃希菌菌液，过滤，用SCP冲洗，同法操作。

(3)供试品组：取供试液100mL于薄膜过滤器的滤膜上，同法操作。

(4)中和剂、阴性对照组：分别取100mL中和剂和SCP按照供试品组同法操作。

表1 需氧菌总数回收率

培养基	菌种	试验次数	菌液对照组菌落数(个)	试验组菌落数平均值(个)	供试品组菌落数平均值(个)	中和剂对照组菌落数平均值(个)	中和剂对照组回收率%	供试品组回收率%
TSA	CMCC(B)10104	1	71	61	0	56	79	86
		2	73	64	0	58	80	89
		3	78	61	0	62	80	79
	CMCC(B)26003	1	72	63	0	61	85	87
		2	79	55	0	61	78	70
		3	85	60	0	64	76	70
	CMCC(B)63501	1	87	60	0	63	73	69
		2	75	56	0	62	83	76
		3	83	54	0	60	73	65
	CMCC(F)98 001	1	86	55	0	56	66	64
		2	89	62	0	59	67	70
		3	89	64	0	56	63	72
	CMCC(F)98003	1	76	56	0	61	81	74
		2	87	59	0	65	75	68
		3	85	69	0	63	75	82

图1 需氧菌总数回收率分布图

表 2 霉菌及酵母菌总数回收率

培养基	菌种	试验次数	菌液对照组菌落数(个)	试验组菌落数平均值(个)	供试品组菌落数平均值(个)	中和剂对照组菌落数平均值(个)	中和剂对照组回收率%	供试品组回收率%
SDA	CMCC(F)98 001	1	71	61	0	62	88	86
		2	73	64	0	61	84	89
		3	78	61	0	63	81	79
	CMCC(F)98 003	1	72	63	0	59	82	87
		2	76	60	0	57	75	79
		3	73	58	0	62	85	80

图 2 霉菌及酵母菌总数回收率分布图

表3 大肠埃希菌控制菌检查结果

试验次数	1					2					3
	试验组	阳性菌组	中和剂对照组	供试品对照组	阴性对照组	试验组	阳性菌组	中和剂对照组	供试品对照组	阴性对照组	试验组	阳性菌组	中和剂对照组	供试品对照组	阴性对照组
胰酪大豆胨液体培养基	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-
麦康凯液体培养基	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-
麦康凯琼脂培养基	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-	+	+	-	-	-

2.2.2选择和分离

取上述TSB培养物，轻摇混匀，各取1mL分别接种100mLMCB中，置培养箱(42～44  ℃)中培养24～48h。取MCB培养物分别划线接种至MCA平板上，置培养箱(30～35℃)中培养18～72h。

2.2.4结果判定

若供试品在麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的坚定试验，确认是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。

2.2.5试验结果

试验组、阳性对照应检出大肠埃希菌，供试品组、中和剂组、阴性对照组不得检出大肠埃希菌。实验结果如表3所示。结果表明供试品采用加大稀释倍数，加入中和剂(5%聚山梨酯80作为助溶剂、氯化钙作为消除酮羰基形成螯合物干扰与甘氨酸作为消除麦角碱类衍生物酸碱中和及酮类化合物干扰)，薄膜过滤法三者结合对其中和后进行微生物限度计数、控制菌检查方法适用性试验，证实采用的方法可有效消除其抑菌性，计数方法适用性回收率在50%～200%范围内，控制菌(大肠埃希菌)适用性试验满足要求。

2.3讨论

2.3.1供试液的制备方式

尼麦角林为非水溶性原料通过本法采用中和剂为少量 5%吐温-80作为助溶剂解决了在稀释剂中不溶而致颗粒包裹的微生物无法释放导致漏检现象，适当的加入氯化钙作为消除金属络合物干扰与甘氨酸作为消除麦角碱类衍生物酮类化合物干扰)。试验结果表明采用的方法配制供试品可有效解决其非水溶性处理难得问题及排除其他因素导致的抑菌性，计数方法适用性回收率在50%～200%范围内，控制菌(大肠埃希菌)适用性试验满足要求。

2.3.2冲洗次数的确认

本研究对薄膜过滤的冲洗次数进行了验证，当冲洗次数为8次时，,冲洗量达800mL，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验回收率在50%～200%之间，控制菌检查阳性菌生长良好,阴性菌均未检出， 本方法符合验证要求。

3结语

本试验由于麦角林原料是一种是淡黄色结晶性粉末，其稳定性差，在乙醇和丙酮中易溶,在水中不溶。通过对供试品加大稀释倍数，加入中和剂(5%聚山梨酯80作为助溶剂、氯化钙作为消除酮羰基形成螯合物干扰与甘氨酸作为消除麦角碱类衍生物酸碱中和及酮类化合物干扰)，采用薄膜过滤法，用pH值为7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗过滤，可以有效地进行尼麦角林微生物限度计数和控制菌检测。

本试验方法的建立，提供了解决尼麦角林其非水溶性处理难等问题及排除其他因素导致的抑菌性，的方法，试验结果满足《中国药典》2020 版通则1105、1106、1107要求，可为非水溶性原料药的微生物限度检查方法的研究提供借鉴思路。

参考文献：

[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典(2020 年版四部)[M].北京：中国医药科技出版社，2020.

[2]豆妮娜，马海艳，李岑，等. 尼麦角林的临床研究进展及应用[J]. 卒中与神经疾病，2013，20(2)：118-120.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2019.

[4]《药品生产质量管理规范》（2010版）及其附录。

第一作者简介：王世峰，制药工程师，海南斯达制药有限公司，药品研发及生产制造方向。