基于斑马鱼模型的地塞米松诱导骨质疏松的作用研究

胡佳田晶晶

【摘要】目的：探究在斑马鱼模型下地塞米松诱导骨质疏松的作用效果。方法：选取3dpf～9dpf的斑马鱼，根据培养基成分的不同分为空白组、阴性对照组以及不同浓度梯度的实验组，培养至9dpf后对斑马鱼各处骨骼进行茜素红染色，观察不同组斑马鱼骨骼染色面积及染色累计光密度。结果：空白对照组染色面积43463单位，累计光密度16223单位；阴性对照组染色面积43073单位，累计光密度16170单位；1μmol/L实验组染色面积41988单位，5μmol/L实验组染色面积29639单位，10μmol/L实验组染色面积26327单位，15μmol/L实验组染色面积23221单位，20μmol/L实验组染色面积20643单位。结论：地塞米松可使斑马鱼骨骼矿化量及骨密度降低，在5μmol/L～20μmol/L的浓度梯度内地塞米松对斑马鱼骨骼发育的不良影响随浓度而扩大，在斑马鱼模型下地塞米松可呈浓度依赖性诱导骨质疏松的产生。

【关键词】斑马鱼模型；地塞米松；骨质疏松。

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）01-0131-02

骨质疏松症是由于骨组织的代谢紊乱所导致的一种骨密度降低、骨骼矿化量降低，骨折风险增大的一种常见疾病[1]，逐渐成为威胁我国人民生存状况的一大恶因[2]。地塞米松作为常用抗炎抗过敏药物，会产生诱发骨质疏松的不良反应[3]，从而影响他的适用范围。有研究表明斑马鱼幼鱼具有完整的成骨与破骨体系，且其关键调控基因与人类基因具有同源性[4]。相较于大鼠等模式生物，斑马鱼模型耗时短、实验成本及实验难度低、实验效率高、灵敏度高[5]，适合建立骨质疏松模型并进行药物高通量筛选。本次实验为验证地塞米松对于骨质疏松的诱发作用，同时为探究选择新的骨质疏松实验模型，特选择斑马鱼用作模式生物。建立不同浓度梯度的地塞米松药物处理组与空白对照组、阴性对照组，观察不同组别的骨质疏松程度。

1.资料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物斑马鱼成鱼（TubABC种系），28℃恒温，循环水。

1.1.2实验试剂茜素红S染料；多聚甲醛；地塞米松；高纯水。

1.1.3实验仪器ZEISS荧光倒置显微镜Axioobserver.A1；生化培养箱SPX-80；Imageproplus6.0专业图像分析软件。

1.2实验方法

1.2.1药物的配置称取称取地塞米松以DMSO配置成2000μmol/L的储备液，再用培养基稀释成1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L含0.5%DMSO溶液的培养基。

1.2.2给药方法将3dpf的斑马鱼放入12孔板中培养，每孔5条斑马鱼，每孔加入2ml培养基[6]；自4dpf开始使用含药培养基培养，将原培养基全部吸净后每孔加入含药培养基2ml，空白对照组加入纯培养基、阴性对照组加入含0.5%DMSO的培养基、实验组分别加入1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L含0.5%DMSO溶液的培养基[7]。每天进行一次半换药，至9dpf取样。

1.2.3茜素红染色取培养至9dpf的斑马鱼幼鱼，麻醉致死后在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定2h；洗净后置于50%乙醇室温静置10min；洗净后使用0.5%KOH配制的茜素红染色液染色，4℃放置过夜；染色后使用双氧水与KOH配置的漂白液漂白，后保存至甘油溶液中封片以待观察[8]。

1.2.4骨骼矿化量及骨密度分析用荧光显微镜观察斑马鱼头部骨骼情况[9]，以同样的光强度与曝光设置采集图像并使用Imageproplus6.0专业图像分析软件分析染色面积与累计光强度。

1.3统计学处理

用SPSS18.0软件进行统计学分析。用均数±标准差的形式对计量资料进行表示，行t检验，使用χ2检验计数资料，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1斑马鱼骨密度情况对比

采用Imageproplus6.0专业图像分析软件观察染色面积，空白对照组染色面积43463单位，阴性对照组染色面积43073单位，1μmol/L实验组染色面积41988单位，5μmol/L实验组染色面积29639单位，10μmol/L实验组染色面积26327单位，15μmol/L实验组染色面积23221单位，20μmol/L实验组染色面积20643单位。1μmol/L实验组累计光密度较阴性对照组减小不明显，无统计学意义；5μmol/L～20μmol/L的浓度梯度内斑马鱼骨密度随地塞米松浓度的增加而减小，组间比较有统计学意义。

2.2斑马鱼骨矿化量情况对比

采用Imageproplus6.0专业图像分析软件计算累计光密度值（IOD），空白对照组累计光密度16223单位，阴性对照组累计光密度16170单位，1μmol/L实验组累计光密度15435单位，5μmol/L实验组累计光密度13227单位，10μmol/L实验组累计光密度11096单位，15μmol/L实验组累计光密度9267单位，20μmol/L实验组累计光密度7653单位。1μmol/L实验组累计光密度较阴性对照组明显减小，5μmol/L～20μmol/L的浓度梯度内斑马鱼骨矿化量随地塞米松浓度的增加而明显减小，组间比较有统计学意义。

表1斑马鱼染色面积及累计光密度值对比

3.讨论

斑马鱼作为最新的模式动物，其骨骼发育体系与人类骨骼发育类似，均由神经嵴发育而来，具有完整的骨形成与骨吸收体系[10]。同时斑马鱼由于实验难度小、实验成本低、灵敏度高等原因，被广泛用于高通量药物筛选的模式动物。有研究报道斑马鱼脊柱骨骼骨化机制相较于头部骨骼骨化机制，与哺乳动物差异较大[11]，故本次实验选取斑马鱼头部骨骼进行观察。

有研究表明，地塞米松可用于诱导骨质疏松的形成从而为抗骨质疏松的药物筛选提供模型[12]。本次实验使用不同浓度梯度的地塞米松处理斑马鱼幼鱼，得到梯度实验结果，认为地塞米松诱导的斑马鱼的骨质疏松模型切实可靠，克服了大鼠模型成本高、难度大、灵敏度低的不利因素，适宜用作建立骨质疏松模型。

多次临床实验表示地塞米松对患者骨骼发育会产生不良影响[13]，本次实验也证明了此观点，为地塞米松的用药提供了进一步的临床指导意义。而斑马鱼模型的建立有利于高效快速的抗骨质疏松药物筛选，期待临床上骨质疏松的治疗效果可以得到进一步的提升。

【参考文献】

[1]徐苓.骨质疏松症的流行病学[J].中国骨质疏松杂志,1996,38(1):1744-1746.

[2]杨林,陶天遵,刘枫晨.地塞米松对成人成骨细胞增殖和分化影响的实验研究[J].中华骨科杂志,2001,21(8):493-497.

[3]孙智慧,贾顺姬,孟安明.斑马鱼:在生命科学中畅游[J].生命科学,2006,18(5):431-436.

[4]贾顺姬,孟安明.中国斑马鱼研究发展历程及现状[J].遗传,2012,34(9):1082-1088.

[5]韦英杰,王长梅,蔡雪婷,etal.地塞米松影响骨骼发育的斑马鱼模型的建立[J].药学学报,2013(2):255-260.

[6]李淼.地塞米松磷酸钠导致斑马鱼颅面部发育异常的研究[D].华中科技大学,2009.

[7]秦伟,齐玉娟,胡占英,etal.斑马鱼骨质疏松模型的建立及在药物筛选中的应用[C]//全国斑马鱼研究大会.2013.

[8]许冰洁,张立将,李春启,etal.斑马鱼胚胎评价5种药物的发育毒性与模型验证[J].中国药理学通报,2016(1):74-78.

[9]薛司徒,秦伟,刘宗英,etal.基于斑马鱼骨质疏松模型评价一组2-乙酰苯并五元杂环类化合物的抗骨质疏松活性[J].中国医药生物技术,2015,V10(3):211-217.

[10]秦帅,陈希,孔德明.构建由绿色荧光标记巨噬细胞的转基因斑马鱼系[C]//贵州省中西医结合内分泌代谢学术会.2012.

[11]王勇生,桂淑玉,李永怀.过敏性哮喘大鼠模型的建立及地塞米松对其的影响[J].中国医药导报,2007,4(22):39-41.

[12]苏幸.Wnt16基因CRISPR/CAS9敲除对斑马鱼骨骼发育影响的初步研究[D].2016.

[13]刘和娣,李恩.补肾方药对地塞米松诱发的骨质疏松大鼠体内雌激素和1,25羟…[J].中国中西医结合杂志,1993(9):544-545.