不同乙醇浓度对斑马鱼心脏发育的影响

黄文慧

关键词乙醇;斑马鱼;心脏发育;毒害作用；石蜡切片；HE染色

斑马鱼（Daniorerio）是一种发现于印度和巴基斯坦水域的热带鱼，被广泛应用于发育生物学和遗传学等研究领域，近年来正逐渐用于人类疾病模型的构建及药物筛选方面的研究[1]。乙醇是一种有机物，在常温、常压下是一种易燃、易挥发的无色透明液体。乙醇对胚胎的致畸作用在许多脊椎动物中都有发现[2]，经生物学研究发现斑马鱼胚胎循环系统及关键基因的活性对乙醇非常敏感，随着乙醇浓度的升高，不完整的循环系统等畸形率也逐渐升高[3]。

1实验材料

1）实验用鱼：本实验用斑马鱼（Barchydanioreriovar）为未成熟的幼鱼，均于保定市花鸟鱼虫市场由专人统一购入，用在室温下放置过一段时间的水（去除氯气，防止其对鱼产生毒害作用）饲养两周。

2）实验试剂：乙醇来自河北大学生命科学学院发育实验室，纯度为95%，实验过程中需要用去氯自来水配置乙醇（100%、95%、85%、75%、70%、50%、30%）用于斑马鱼的培养、石蜡切块和HE染色。

2实验过程及方法

本组共6人，每两个人为一个实验组，其中两人为一个对照组（空白对照）、0.5%乙醇、1%乙醇，每组做两个平行实验，每个烧杯中放8条斑马鱼置于配好的不同浓度的酒精溶液培养。10月10日至10月23日期间为斑马鱼的培养时间，在此过程中不断记录斑马鱼的换水、喂食的时间及次数，每周计算斑马鱼的体长、体重、存活率至23日，之后进行解剖取材、固定、石蜡包埋、切片、HE染色、普通显微镜下结果观察、显微摄影。

表1.不同浓度乙醇对斑马鱼体重的影响

据表1分析以及同组人员的实验对照探究发现：1%乙醇组的斑马鱼在短时间内死亡率最高，0.5%乙醇组次之，空白对照组最末。可能原因：

①乙醇溶液的浓度可能是直接影响因素，由此可见乙醇对其的毒害作用可能随浓度升高而增强（待后续分析）。

②从第一条鱼死亡后溶液中可能残留毒素，其可能会对其余存活的鱼有毒害作用。

③换水问题。即培养液浑浊程度亦会影响斑马鱼的生长。

根据各实验组及对照组体重数据绘制散点图并计算回归方程如图1。

图1.斑马鱼的平均体重与乙醇浓度的关系

据图2可知，斑马鱼的平均体重与乙醇浓度呈正相关，且相关程度呈线性关系。斑马鱼的平均存活数与乙醇浓度近似呈现负相关，但并未呈现严格的线性关系。可推测随着乙醇浓度的增加，斑马鱼的存活数下降。原因是乙醇不利于斑马鱼的生长，甚至有毒害作用。

两周饲养期结束，挑选本实验组（对照组）长势良好、体型适中的斑马鱼进行解剖，将要取材的斑马鱼进行冰冻处理，使其活动能力下降，将斑马鱼固定在小蜡盘上，用大头针固定，对其进行解剖，找出斑马鱼的一些器官，放入固定瓶中，接下来进行石蜡切片及HE染色，下图是使用DP71显微镜在10倍、20倍和40倍物镜下进行显微摄影拍摄斑马鱼心脏部位的石蜡切片，以20倍为例。

图2经染色后20倍物镜下的心脏显微图片

3实验结论与分析

根据显微图片显示：切下的部分为心脏的肌肉部分，其中占大多数的是心肌细胞，并未观察到明显的心脏各部腔室的区分。根据小组间对不同乙醇浓度实验组的心脏切片的显微观察，我们观察到空白对照组的心脏切片组织分明，可以观察到分明的心肌细胞于心脏切片边缘较为有序排列；对于0.5%乙醇组的心脏切片我们可以看到心肌组织较为致密。而1%乙醇组的心脏玻片较0.5%乙醇组和空白对照组的心脏形态明显不同，即心脏出现了局部水肿的情况，并且心脏组织的致密性亦不及前两组。通过平行对照，我们可以得出的结论是：

1）乙醇对于斑马鱼心脏有毒害作用，具体表现在心脏的形态和结构等方面。

2）随着乙醇浓度的升高，其对斑马鱼的毒害作用越明显。

结论：

值得反思的是，本文利用乙醇与斑马鱼开展的自主实验对乙醇的致畸作用有了初步的认识与进展。另外，作为一种维生素A的生物活性形式，视黄酸（RA）可以降低甚至能逆转乙醇在胚胎心脏发育中的毒性。RA信号对心脏发育起重要作用，可影响心肌细胞分化、早期心脏前后模式的形成、左右决定、心内膜垫的形成及心脏环化。而斑马鱼是研究脊椎动物早期发育的最重要的模式动物之一，利用斑马鱼研究乙醇影响心脏发育的机制是可行的。由此可见，本实验利用斑马鱼得出的乙醇致畸的实验结论是可信的.

参考文献

[1]王思锋,刘可春,韩利文等.溶剂乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响[A].济南:山东科学.2007,20(3):10-11.

[2]龚春华,李军,秦玉明等.乙醇对斑马鱼胚胎发育中tenascin-c基因表达的影响[A].南京:实用儿科临床杂志.2008,23(1):55-56.

[3]钱林溪,王跃祥,蒋璆等.乙醇干扰斑马鱼胚胎发育中底索和背主动脉的形成.上海:中国科学C辑.2005,35(4):326-327.