Tricine系统检测低分子量蛋白酶抑制剂的电泳方法研究

作者：廖海 周嘉裕 高冬梅 黄丹娥 靳晓娥 李利平

【摘要】 　　目的建立一种能够检测不同分子大小（尤其是低分子量）蛋白酶抑制剂的电泳方法。方法根据特异蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶活性的原理，借助明胶-Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，胶板经蛋白酶水解后，以考马斯亮蓝染色。结果小分子量的胃蛋白酶抑制剂与较大分子量的BBI均能在该方法中显示出活性带，并且利用该方法检测到山合欢种子中含有一种胰蛋白酶抑制剂。结论该方法能够满足不同分子大小、不同类型蛋白酶抑制剂检测的需要。山合欢胰蛋白酶抑制剂的发现对山合欢进一步的研究和综合开发有重要意义。

【关键词】 山合欢 Tricine系统 蛋白酶抑制 电泳

　　Abstract：ObjectiveTo establish an detecting method for protease inhibitors, especially for low-molecular-weight inhibitors. MethodsInhibitor samples were separated on a gelatin-SDS-PAGE in a Tris-Tricine buffer system. After electrophoresis, the gel was incubated with the target proteases to hydrolyze the background gelatin. The inhibitor bands, which were undigested by the target proteases, were stained.ResultsLow-molecular-weight inhibitor (pepstatin A) and larger inhibitor (soybean Bowman-Birk inhibitor) were demonstrated by this method and showed clear blue inhibitor bands in the white background. By this method, a trypsin inhibitor was detected from the seeds of Albizzia kalkora (Roxb.) Prain. ConclusionThis method not only fit for inhibitors with different molecular mass, but fits for inhibitors with various species. Moreover, the trypsin inhibitor found in Albizzia kalkora is important for further research and overall exploration.

　　Key words：Albizzia kalkora (Roxb.) Prain； Tricine buffer system； Protease inhibitor; Electrophoresis

　　蛋白酶抑制剂是一类可以抑制靶蛋白酶水解活性的功能多肽，参与体内许多重要生理过程的调节，广泛存在于豆科、禾本科及葫芦科等植物的种子及块茎中［1］。此外,动物的血液、精液、胰脏中以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有蛋白酶抑制剂的存在［2］。蛋白酶抑制剂具有抗炎抗感染的能力，已被广泛用于治疗急性胰腺炎，烧伤后休克及产后大出血等疾病［3］。更重要的是许多临床前研究发现蛋白酶抑制剂具有降糖、抗辐射、抑制因不良环境因素引起的癌转化过程、抑制肿瘤细胞生长的作用，有可能开发出新型的治疗糖尿病、抗癌药物［4～6］。因此寻找及利用蛋白酶抑制剂是极具研究意义的。由于蛋白酶抑制剂属于小分子多肽，有些蛋白酶抑制剂的分子量甚至小于1 000，为了能从材料中寻找新的蛋白酶抑制剂，建立适合于低分子量蛋白酶抑制剂的检测方法十分必要。我们采用Tricine系统，在分离胶中加入明胶，电泳分离样品后，胶板以特定蛋白酶水解，最后用考马斯亮蓝染色的方法，建立了一种满足不同分子量大小、不同类型的蛋白酶抑制剂检测需要的电泳方法。

　　1 仪器与材料

　　TU-1901紫外分光光度计(北京普析)；Mini Protein III垂直板电泳槽（美国BioBrad公司）；山合欢Albizzia kalkora (Roxb.) Prain的成熟种子采自西南交通大学峨眉校区；Acrylamide、Bisacrylamide、胰蛋白酶、甘氨酸、Tris、Tricine、胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A，分子量为685 Da)为Amresco.产品；胃蛋白酶、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI，分子量为8800 Da)为Sigma产品；其余试剂均为国产分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 山合欢蛋白酶抑制剂粗提物制备按Genov等［7］的方法略加修改。山合欢种子(20 g)打磨成粉，加入200 ml去离子水，室温搅拌提取2 h，离心(6 000 ×g，20 min, 4℃)，沉淀再用100 ml去离子水抽提1次，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，合并2次上清液。加固体硫酸铵至35%饱和度，4 ℃静置过夜，离心(6 000 ×g，20 min，4 ℃)收集上清液。上清液加入固体硫酸铵至55%饱和度，4 °C放置2 h，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，收集沉淀，用少量去离子水溶解，对去离子水充分透析，离心(10 000 ×g，10 min，4℃)，所得上清液即为山合欢蛋白酶抑制剂粗提物，置-20 °C下储存。

　　2.2 合欢蛋白酶抑制剂粗提物抑制活力的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford法［8］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。抑制活力按照Erlanger等人的方法［9］，以实验条件下，与不加抑制剂的样品的吸收值比较，每降低0.1个A410 nm的吸收值为一个抑制活性单位。

　　实验结果：由20 g山合欢种子可以制备得到14 ml粗提物，用Bradford法测定蛋白质含量为0.5 mg·ml-1，测定对胰蛋白酶的抑制活力为202 单位/mg蛋白。实验结果表明山合欢粗提物中含有胰蛋白酶抑制剂。

　　2.3 明胶-SDS-PAGE明胶-SDS-PAGE采用Hanspal等［10］的方法略加修改，分离胶浓度12%(pH 8.8)，分离胶中含有0.2% (W/V)明胶。样品处理液配方：6% SDS，300 mM Tris-HCl，pH 8.0，50%甘油，0. 05%溴酚蓝。样品与样品处理液按2∶1比例混合。电极缓冲液为25 mM Tris，250 mM甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS。电泳完毕后，胶板经去离子水冲洗3次，置于2.5% Triton X-100溶液中复性25 min（两次）。用去离子水冲洗胶板多次，将含有BBI和山合欢粗提物的电泳胶条置于胰蛋白酶酶解缓冲液中，另将含有Pepstatin A的电泳胶条置于胃蛋白酶酶解缓冲液中，37 °C水浴保温30 min，再用考马斯亮蓝R-250染色40 min，10%乙酸-10%乙醇脱色过夜。胰蛋白酶酶解缓冲液配方为100 mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液(内含50 μg/ml胰蛋白酶)。胃蛋白酶酶解缓冲液配方为0.2% NaCl，HCl，pH 3.0缓冲液(内含50 μg/ml胃蛋白酶)。结果见图1。

　　2.4 明胶-Tricine-SDS-PAGE采用Schagger等人建立的Tricine系统［11］并略加修改，分离胶为12%(W/V)丙烯酰胺，0.32%(W/V)双丙烯酰胺，0.2%(W/V)明胶，10%(W/V)甘油，0.75 M Tris-HCl，pH 8.45，0.1% SDS。浓缩胶为5%(W/V)丙烯酰胺，0.13%(W/V)双丙烯酰胺，0.33 M Tris-HCl pH 6.8。样品处理液配方及样品的处理与明胶-SDS-PAGE方法相同。电泳时，以0.2 M Tris (pH 8.9)缓冲液为阳极缓冲液，以0.1 M Tris，0.1 M Tricine，0.1% SDS (pH 8.25)缓冲液为阴极缓冲液，电流大小为1 mA/孔，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时停止电泳。电泳完毕后，胶条的处理过程与明胶-SDS-PAGE相同。结果见图2。

　　3 讨论

　　明胶-SDS-PAGE是根据Laemmli系统而建立的检测蛋白酶抑制剂的常用电泳方法［10］。该方法适合于检测较高分子量的蛋白酶抑制剂，如BBI在明胶-SDS-PAGE中能观察到清晰的抑制活性带(图1a)。然而在传统Laemmli系统中，小分子短肽的浓缩是较困难的，因为小分子短肽与SDS形成的复合体具有与SDS本身类似的电荷和大小，会出现短肽-SDS复合物与SDS颗粒共迁移的现象，导致分子量小于1 kDa的短肽无法取得较好的分离效果［11，12］。如图1c中，含有Pepstatin A的电泳胶条未发现有抑制活性带的出现。Schagger等［11］报道了一种改进的Laemmli 法, 用Tris-Tricine体系代替Tris-glycine体系后可很好地分离分子量在1～100 kD的蛋白质。该方法降低了分离胶的pH值(pH 8.45)，使蛋白质的移动速度变慢，提高了电泳分辨率；其次，采用不连续的电极缓冲体系和使用Tricine替代甘氨酸作为慢迁移离子，解除短肽-SDS复合物与SDS颗粒的共迁移效应，改善小分子量短肽的电泳效果［11］。我们首先考察该方法的灵敏度，结果发现500 ng的BBI在明胶-Tricine-SDS-PAGE中能观察到清晰的抑制活性带(图2a)，其电泳迁移率要低于明胶-SDS-PAGE，表明该方法具有很高的灵敏度。更为重要的是Pepstatin A在明胶-Tricine-SDS-PAGE中能够观察到一条清晰的抑制活性带(图2c)。以上结果表明该方法的优点在于灵敏度高，能够检测不同类型、不同分子大小的蛋白酶抑制剂，弥补了明胶-SDS-PAGE无法检测低分子量蛋白酶抑制剂的缺陷，从而为大量样品的筛选工作提供了有效、快捷的技术手段。

　　山合欢Albizzia kalkora属豆科含羞草亚科乔木。近年来发现山合欢皮具有镇静安神、抗抑郁等功效［13, 14］，是一种极具开发价值的药用植物。但一旦山合欢皮被使用后，会损坏树木，破坏生态环境。山合欢种子一般在秋天结果后作为废料任其自然消失，未充分加以利用。因此，在应用山合欢皮时，应同时开发山合欢种子，一可充分利用自然资源，二可保护环境。我们分别利用明胶-SDS-PAGE和明胶-Tricine-SDS-PAGE检测了山合欢粗提物，结果均发现只有一条抑制活性带(图1b，图2b)，说明山合欢种子只含有一种胰蛋白酶抑制剂。迄今未见国内外有关山合欢胰蛋白酶抑制剂的报道。因此，本实验结果对山合欢进一步的研究和综合开发具有重要意义。对此我们将进一步分离纯化这种胰蛋白酶抑制剂，并进行抑制肿瘤细胞实验。

【参考文献】
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