简介：摘要目的建立流式细胞术(FCM)检测中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的表达方法，探讨NETs在脓毒症相关凝血功能障碍(SAC)患者中的临床诊断价值。方法收集2018年5月至2019年6月苏州大学附属第二医院50例非脓毒症者和21例脓毒症患者抗凝血。脓毒症患者符合3.0定义的诊断标准，血培养鉴定出革兰氏阴性菌，D二聚体含量>0.5 mg/L，彩色多普勒超声检查显示血栓形成，即时收集外周血样。采用别藻蓝蛋白(APC)标记的白细胞分化抗原66b(CD66b)识别多型分叶核细胞(PMNs)，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗髓过氧化物酶(MPO)抗体耦联PMNs膜表面MPO，Sytox orange(SO)核酸染料标记脱氧核糖核酸(DNA)，建立FCM检测全血NETosis相关标志物方法。7-氨基放线菌素D(7-AAD)染料观察溶血对细胞膜完整性的影响，进行NETosis相关标志物(SO/MPO)的特异性检测。受试者工作特征(ROC)曲线分析NETosis相关标志物和白细胞总数(WBC)在SAC患者中的灵敏度和特异性，用Mann-Witney统计量的非参数法估计ROC曲线下面积(AUC)，AUC的比较采用配对设计的两相关诊断试验差异假设检验。结果全血分离的PMNs与FACS试剂溶血后的PMNs对7-AAD的阴性表达率比较，两者差异无统计学意义[(95.1±6.6)%比(93.5±5.7)%，t＝1.984，P>0.05]。NETosis相关标记物SO/MPO不能识别Etoposide药物诱导的PMNs凋亡(Apoptosis)。ROC曲线分析SAC患者的AUC，NETosis相关标记物取2.5%时的AUC高于WBC取8.0×109/L时的AUC(0.97比0.72，Z＝2.011，P<0.05)，差异有统计学意义。结论FCM检测外周全血PMNs上NETosis相关标志物具有良好的敏感性、特异性，在SAC诊断中有重要临床价值。

简介：摘要目的探讨抗磷脂综合征(APS)血栓形成的炎症环境中自噬是否参与多型核中性粒细胞(PMNs)释放中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，以及IFN-λ1(IL-29)是否具有抑制NETs相关凝血酶生成的作用。方法体外研究活动期APS患者血清刺激健康志愿者外周血分离的PMNs，IL-29和3-甲基腺嘌呤(3-MA)作为NETs释放和自噬的调节因子，通过免疫荧光技术(IFT)和流式细胞术(FCM)评估NETs的表达，Western blot检测自噬相关蛋白的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物水平。结果将APS患者血清刺激健康人PMNs释放的NETs作为对照组，其免疫荧光技术检测表达水平为(22.8±3.1)%，流式细胞术分析表达水平为(10.1±2.7)%。IL-29和3-MA抑制了APS患者血清刺激的健康人PMNs上NETs的释放，免疫荧光技术检测表达水平分别为(5.3±2.2)%和(4.9±2.4)%，流式细胞术分析的表达水平分别为(2.1±1.3)%和(2.7±1.4)%，与对照组相比差异均有统计学意义(q＝9.89、10.67、11.74、9.61，P均<0.01)。IL-29抑制了APS患者血清刺激的健康人PMNs上LC3B的表达，促进了p62的表达，与APS患者血清刺激的健康人PMNs中自噬相关蛋白的表达水平相比，差异均有统计学意义[LC3B/GAPDH：(0.28±0.03)% vs(0.77±0.06)%，q＝8.65；p62/GAPDH：(0.63±0.05)% vs(0.33±0.03)%，q＝4.78；P均<0.01]。IL-29和3-MA降低了NETs相关TAT复合物的水平，与APS患者血清刺激健康人PMNs释放的NETs相关TAT复合物水平比较，差异均有统计学意义[(3.1±0.5)ng/ml和(4.7±0.4) ng/ml vs(7.6±0.6) ng/ml，q＝6.34和5.15，P均<0.01]。结论自噬机制参与了APS血栓形成患者血清刺激的健康人PMNs中NETs的释放以及随后的凝血级联激活，IL-29通过抑制自噬减少NETs的生成以及其相关凝血酶的产生。