简介：摘要目的探究γ-氨基丁酸(GABA)能视网膜神经节细胞的中枢投射区域以及投射到上丘的GABA能视网膜神经节细胞在视网膜中的分布情况及其形态特点。方法取6只GABA转运蛋白(vGAT)-cre转基因小鼠(实验1组)及6只野生型C57BL/6小鼠(对照1组)，于双侧眼内玻璃体腔注射腺相关病毒rAAV-EF1α-DIO-EGFP-EGFP；取6只vGAT-cre转基因小鼠(实验2组)及6只野生型C57BL/6小鼠(对照2组)，于脑内双侧上丘注射腺相关病毒rAAV-EF1α-DIO-EGFP-EGFP。注射病毒后42 d时，取6只实验1组、6只对照1组及3只实验2组、3只对照2组小鼠的视网膜、视神经、脑组织，行冰冻切片的免疫荧光双标染色以检测绿色荧光蛋白(GFP)和GABA的表达；对3只实验2组、3只对照2组小鼠的全视网膜铺片行免疫荧光双标染色以检测GFP和转录因子Brn3蛋白(BRN3A)的表达并统计阳性细胞数、细胞胞体大小。结果实验1组小鼠的视网膜内核层、内网状层、神经节细胞层均可见到表达GFP的绿色荧光信号和表达GABA的红色荧光信号共标，视神经中可见表达GFP的绿色荧光信号沿轴突纤维呈线样排列，外侧膝状体和上丘区域的脑组织中也可见到表达GFP的绿色荧光信号；而对照1组小鼠视网膜上无绿色荧光信号。实验2组小鼠的视网膜上表达GFP的绿色荧光信号与表达GABA的红色荧光信号存在共标，投射至上丘的GABA能视网膜神经节细胞以中小型细胞(直径12~16 μm)为主，其数量占细胞总数的(37.70±5.33)%，占所有神经节细胞(BRN3A阳性)的(7.27±0.81)%。结论GABA能视网膜神经节细胞向脑内外侧膝状体及上丘区域投射，在视网膜上呈均匀分布且以中小型细胞为主。

简介：摘要目的观察不同浓度氯喹对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）损伤模型小鼠RGC的保护作用及可能调控机制。方法健康雄性C57/BL6小鼠54只，随机分为氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组，每组均为18只。氯喹低浓度组、氯喹高浓度组小鼠分别按体重10、100 mg/kg剂量腹腔注射氯喹；PBS组小鼠腹腔注射等体积PBS。腹腔注射1次/d，连续2d后，氯喹低浓度组、氯喹高浓度组小鼠左眼玻璃体腔注射5 nmol/L NMDA，对侧眼注射等体积PBS。建模后7d，视网膜铺片RGC染色，计数RGC存活数目；建模后9、10d，分别行视动反应和ERG检查；建模后11 d，行视网膜免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白（GFAP）荧光表达和实时荧光定量PCR （RT-PCR）检测各组小鼠视网膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表达。各组间RGC密度、视敏度、光负性反应（PhNR）波振幅比较采用单因素方差分析。结果建模后7d，与PBS对照组小鼠RGC密度比较，氯喹低浓度组显著升高，差异有统计学意义（F=54.41，P<0.01）；氯喹高浓度组降低，但差异无统计学意义（F=1.18，P>0.05）。氯喹低浓度组小鼠视敏度、PhNR波振幅均高于PBS对照组，差异有统计学意义（F=9.10、17.60，P<0.05、<0.01 ）。氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组，差异有统计学意义（F=23.66，P<0.05 ）。低浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP （F=110.20）、IL-6 （F=167.60）、TNF-α （F=17.78）mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组显著下降，差异有统计学意义（P<0.010、<0.001、<0.010）。结论低浓度氯喹对NMDA损伤所致RGC丢失有保护作用，其作用机制可能与抑制胶质细胞活化与炎症反应有关；高浓度氯喹会加重RGC凋亡。

简介：摘要X连锁视网膜劈裂症（XLRS）是一种X染色体隐性遗传视网膜疾病，以双侧视网膜受累多见。患者常表现为视力损害、内层视网膜劈裂所致黄斑区轮辐状囊样改变以及视网膜电图b波相对于a波不成比例的下降。目前针对此病尚无有效的治疗方法，通常以并发症的治疗为主。近年来随着人们对XLRS认识的不断加深，腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗成为了干预该病潜在的新途径。目前有两项XLRS基因治疗临床试验正在开展。这两项临床试验评估了重组AAV-RS1载体的眼部安全性和耐受性，同时探索了其在XLRS患者中使用的安全剂量，但XLRS患者视网膜结构和功能的恢复情况并不理想。相信随着各项研究的深入和临床试验的进展，未来有望为XLRS患者提供更精准有效的治疗。

简介：摘要目的：研究明/暗适应时间对正常成年食蟹猴闪光视网膜电图（ERG）结果的影响。方法：实验研究。选取3只成年食蟹猴，分别于暗适应20、40、60 min后用国际临床视觉电生理会标准参数刺激，常规程序记录暗适应ERG，在暗适应40 min后，分别明适应1、5、10 min记录明适应ERG。采用单因素方差分析比较各时间段振幅与潜伏期变化。结果：不同暗适应时间，a、b波和震荡电位OPs的潜伏期差异均无统计学意义（F=0.052，P=0.949），暗适应时间小于40 min时，a、b波和OPs的振幅随暗适应时间增加而显著增大（F=50.800，P<0.001）；暗适应40 min时，振幅达到最大，且不再随暗适应时间增加而增大（F=0.016，P=0.899）。明适应a、b波的潜伏期同样不受明适应时间的影响（F=0.980，P=0.381），a、b波的振幅在明适应5 min后达到最大（F=4.789，P=0.036）且随时间延长趋于平稳（F=0.135，P=0.717）。结论：在一定时间内，明/暗适应时间对食蟹猴闪光ERG结果影响较大，故对食蟹猴暗适应ERG记录的时间不宜少于40 min，而明适应ERG在5 min后即可记录。

简介：摘要视网膜退行性病变是由于视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞功能改变所致的致盲性眼病。干细胞移植、基因治疗、视网膜假体植入等新生物学技术在视网膜退行性病变患者视觉功能恢复上已经取得巨大的进步，但目前仍然面临许多困难。光遗传学是一种将光学、生理学和遗传学结合的交叉学科的新技术，可将光敏蛋白表达在视网膜退行性病变的视网膜神经元上，利用光刺激表达光敏蛋白的细胞，通过产生去极化或超极化反应，使其重获感光能力。相较于干细胞移植治疗的免疫排斥、基因治疗的个体化差异及视网膜假体植入的创伤性大等局限，光遗传学技术具有显著优势，同时也亟待解决时空分辨率低和光敏感性不足的问题。随着光遗传学技术的逐步发展，其必然和其他领域形成更深层次地交叉、融合，从而有助于视网膜退行性病变患者视觉功能的恢复。

简介：摘要腺相关病毒载体（AAV）是目前最重要的病毒工具，已在基因治疗领域得到广泛应用；因其具有体积小、无包膜、无致病性等特点，故而是治疗遗传性视网膜疾病的主要手段之一。目前针对原癌基因酪氨酸激酶基因治疗视网膜色素变性、ND4基因治疗Leber遗传性视神经病变以及Rab伴随蛋白-1基因治疗无脉络膜症的临床试验均发现约一半的患者视力改善。针对AAV基因治疗Leber先天性黑矇、X连锁视网膜劈裂症、全色盲以及老年性黄斑变性的临床试验也正在开展。而关于Stargardt病、Usher综合征、真性小眼球的AAV基因治疗尚在动物实验或理论阶段。目前AAV基因治疗主要用于隐性遗传性视网膜疾病，对于显性遗传性视网膜疾病需采用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术等来干预。对于遗传性视网膜疾病的治疗，这将是一个重要且复杂的系统性工程，需投入更多人力物力共同参与和研究，期待在不久的将来能有大的突破。

简介：摘要目的观察并分析象限性视网膜色素变性（sector RP）的致病基因及临床表型。方法回顾性临床研究。2021年4月于武汉大学人民医院眼科就诊的sector RP一家系的1例患者（先证者）及其父母纳入研究。详细询问病史并行最佳矫正视力（BCVA）、眼底彩色照相、自身荧光（AF）、视野、光相干断层扫描（OCT）、视网膜电图（ERG）、荧光素眼底血管造影（FFA）、吲哚青绿血管造影（ICGA）检查。采集先证者及其父母的外周静脉血3 ml，提取全基因组DNA。全外显子测序，采用Sanger测序及实时定量聚合酶链反应对变异位点进行验证，并进行生物信息学分析和共分离分析。结果先证者男，17岁。双眼视力渐进性下降2年。双眼BCVA均为0.4；视网膜血管变细，黄斑区营养不良，无明显色素沉着；眼底AF检查，鼻下象限视网膜变性呈斑驳影，黄斑呈"花瓣状"强AF；视野检查，双眼对称性颞上方视野缺失；OCT检查，中心凹区域以外光感受器层消失；ERG检查，暗适应波幅降低、明适应呈熄灭状态；FFA和ICGA检查，视盘周围及下方视网膜色素上皮层萎缩。其父母眼部表型正常。基因检测结果显示，先证者SPATA7基因第10号外显子存在一错义突变c.1112T>C（p.Ile371Thr），导致编码的SPATA7蛋白第371号氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸；其母亲携带c.1112T>C杂合突变。根据美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）遗传变异分类标准与指南，该变异为意义不明确变异。同源染色体存在一来源于父亲的拷贝数变异，导致SPATA7基因第10号外显子缺失。根据ACMG指南，该变异为可能致病变异。结论sector RP可累及黄斑，导致黄斑营养不良；SPATA7基因c.1112T>C（p.Ile371Thr）错义突变可能是本家系的致病原因。

简介：摘要目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。结果H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。结论成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。

简介：摘要目的探讨视网膜静脉阻塞（RVO）患者静息状态下脑自发神经活动的改变。方法回顾性病例对照研究。收集2018年5月至2019年7月武汉大学人民医院眼科中心45例RVO患者为RVO组，其中男性24例，女性21例，年龄（51.24±5.86）岁；同期将43例与RVO组性别、年龄等相匹配的健康志愿者纳入健康对照组，其中男性19例，女性24例，年龄（49.79±7.31）岁。对受试者进行全脑静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）扫描，检测分数低频振幅（fALFF）值，分析RVO组相对于健康对照组受试者脑功能自发神经活动的改变，对两组fALFF数据的组内和组间比较分别采用单样本t检验和双样本t检验。结果与健康对照组相比，RVO组的fALFF值存在显著改变，在左侧小脑（-0.68±0.48，t=3.808）、右侧小脑（-0.79±0.47，t=4.590）、右侧脑干（-0.57±0.50，t=3.964）、左侧岛叶（-0.22±0.27，t=3.587）的fALFF值升高；在右侧距状沟（0.60±0.72，t=-3.521），右侧丘脑（-0.68±0.43，t=-3.846）及左侧舌回（-0.12±0.33，t=-3.876）的fALFF值降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论RVO患者存在包括视觉通路及情绪认知处理等多个脑区自发神经活动和功能受损，局部脑区可能存在代偿性脑功能增强。（中华眼科杂志，2020，56：266-271）

简介：摘要目的利用静息态功能磁共振成像(rs-fMRI)的分数低频振幅(fALFF)技术研究糖尿病视网膜病变(DR)患者的静息态脑功能改变。方法采用横断面研究方法，收集2018年7月至2019年3月于武汉大学人民医院就诊的34例非增生性DR患者为DR组，同期于当地社区招募34名年龄、性别、受教育程度相匹配的健康志愿者为正常对照组。所有受检者均接受常规MRI和rs-fMRI检查，计算全脑fALFF值，比较2个组受检者不同脑区fALFF测定值。结果DR组患者左侧颞叶下回、左侧小脑区、右侧苍白球、左侧辅助运动区和右侧眶额叶上回fALFF值分别为-0.58±0.29、-0.47±0.39、-0.37±0.24、-0.31±0.26和0.29±0.49，均明显高于正常对照组的-1.03±0.29、-0.90±0.31、-0.78±0.22、-0.72±0.21和-0.17±0.46，差异均有统计学意义(体素水平P<0.01，高斯随机场校正，聚类水平P<0.05)(均P<0.001)。结论DR患者存在多个脑区的神经元活动异常，包括左侧颞叶下回、左侧小脑区、右侧苍白球、左侧辅助运动区和右侧眶额叶上回。这些异常神经元活动区域可能与认知、视觉、情绪等方面的功能有关。

简介：摘要目的观察新型光敏蛋白PsCatCh2.0转染至视网膜色素变性模型rd1小鼠视网膜1年后视网膜神经节细胞（RGC）对光反应、视网膜炎症及细胞凋亡情况。方法雄性rd1小鼠24只随机均分为rd1实验组、rd1对照组，各12只。rd1实验组小鼠鼻侧角巩膜缘下1 mm处玻璃体腔注射重组腺相关病毒（rAAV）2/2-巨细胞病毒启动子（CMV）-PsCatCh2.0-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）1.5 μl，2周后颞侧角巩膜缘下1 mm处再次注射相同剂量的重组病毒。注射后1年，用膜片钳技术记录表达PsCatCh2.0的RGC对光反应；行免疫荧光染色评估PsCatCh2.0在视网膜中的表达情况；行视网膜铺片染色评估重组病毒的转染效率，并计数RGC；使用苏木精-伊红染色评估内层视网膜厚度；采用蛋白免疫印迹法检测视网膜中核因子（NF）-κB p65的蛋白表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组小鼠视网膜中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）mRNA相对表达量；采用原位末端标记法观察各组小鼠视网膜细胞凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果注射重组病毒后1年，表达PsCatCh2.0的RGC产生的电流约为30 pA。PsCatCh2.0-EGFP与RGC呈共定位表达；少量与无长突细胞共定位，几乎不与水平细胞、双极细胞共定位。rd1实验组、rd1对照组小鼠RGC密度、内层视网膜厚度比较，差异均无统计学意义（F=14.35、0.05，P>0.05）。rd1实验组小鼠视网膜NF-κB p65蛋白表达量以及TNF-α、IL-6 mRNA表达均低于rd1对照组，差异均有统计学意义（F=4.61、5.91、5.78，P<0.05）。rd1实验组小鼠视网膜中呈红色荧光的凋亡细胞数量少于rd1对照组，Bax mRNA表达低于rd1对照组，差异有统计学意义（F=7.52，P<0.01 ）。结论玻璃体腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP后1年，表达PsCatCh2.0的RGC仍可产生光电流；长期转染表达PsCatCh2.0对RGC无明显细胞毒性作用，也不增加视网膜的炎性反应。

简介：摘要目的利用病毒工具研究视网膜到脑的神经环路中神经细胞的形态结构及细胞之间的联系方式，并根据其示踪方向性和跨细胞突触性质，探索其用于研究视觉环路中细胞形态和连接分布情况。方法应用随机数字表法将6～8周龄实验小鼠随机分组，每组4只。野生型C57BL/J小鼠用于荧光金、腺相关病毒(AAV)、伪狂犬病毒(PRV)和1型单纯疱疹病毒129株(H129)示踪实验；转基因鼠GAD2-Cre小鼠用于AAV的示踪实验；转基因鼠Thy1-Cre小鼠用于狂犬病毒(RV)跨单突触示踪实验。病毒方向选择性示踪：(1)逆向示踪　在小鼠双侧上丘注射逆向神经示踪剂荧光金、AAV、PRV或RV，在特定时间点处死小鼠并取视网膜铺片，观察投射到脑的视网膜细胞形态分布和数量；(2)顺向示踪　在小鼠玻璃体腔注射H129等顺向示踪剂，在相应时间点取小鼠的大脑切片，观察视网膜投射到脑的细胞形态分布和数量。结果逆向标记中，荧光金标记到的视网膜神经节细胞比AAV标记到的数量更多，但AAV标记的神经节细胞有更多细胞突起的精细结构，荧光金仅能标记细胞的胞体。玻璃体腔注射H129和视觉投射脑区定位注射PRV能跨多突触后显示环路中串联起来的细胞分级投射。跨单突触示踪病毒，RVG缺失的重组RV在结合辅助病毒后，可有效逆向跨1个突触，标记下一级的细胞。结论AAV病毒通过其携带的荧光蛋白可研究细胞精细的形态学特征。H129、PRV和RV可用于研究视觉环路中神经连接。结合Cre/loxP、Caspase-3、DTA、Gcamp等基因元件技术，病毒工具能精确调控表达特定类型细胞的功能，同时进行非常细致的视觉功能和形态研究。