简介：摘要目的探讨小胶质细胞活化在急性高眼压引起的视网膜缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞（RGC）死亡中的作用及其机制。方法实验研究。取C57BL/6小鼠原代RGC与小鼠小胶质细胞BV2细胞共培养或单独培养，建立体外氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型模拟体内视网膜缺血再灌注损伤（复氧时间分别设为6 h、24 h、36 h、48 h），使用小胶质细胞特异性离子钙接头蛋白（iba1）免疫荧光染色评估BV2细胞活化程度；采用活细胞计数试剂盒检测RGC的细胞活性；应用细胞凋亡检测试剂盒检测RGC凋亡率；通过半定量逆转录PCR、Western印迹、细胞免疫荧光检测BV2细胞中Toll样受体-4（TLR4）与Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）的mRNA及蛋白水平；应用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（caspase-8）染色试剂盒检测BV2细胞中caspase-8活性；酶联免疫吸附试验检测BV2细胞上清液中白细胞介素1β（IL-1β）含量；应用TLR4小干扰RNA（siRNA）转染和caspase-8抑制剂阻断相应通路，对比TLR4、NLRP3的表达、caspase-8的活性变化、IL-1β含量的差异以及共培养RGC的细胞活性变化。采用方差分析进行统计学分析。结果RGC与BV2细胞共培养下，细胞免疫荧光检测显示OGD/R模型中BV2细胞iba1表达增多，BV2细胞显著激活。RGC与BV2细胞共培养下，OGD/R模型中RGC的凋亡率（71.1%±3.2%）高于RGC单独培养下OGD/R模型中RGC的凋亡率（35.1%±1.8%），差异有统计学意义（t=10.10，P<0.01）。细胞免疫荧光检测显示BV2细胞单独培养下，OGD/R模型中BV2细胞TLR4、NLRP3表达显著增加，其mRNA水平均随复氧时间延长显著上升，差异均有统计学意义（F=64.45，72.74；均P<0.01），且在OGD/R复氧24 h时达到峰值（TLR4 mRNA与对照的相对比值为2.83±0.23，NLRP3 mRNA与对照的相对比值为3.12±0.27）；caspase-8的活性也随复氧时间延长显著增加，差异有统计学意义（F=93.57，P<0.01），且在OGD/R复氧24 h时达到峰值（与对照的相对比值为2.92±0.31）。应用TLR4 siRNA转染BV2细胞后其caspase-8的活性明显受到抑制，应用caspase-8抑制剂并不影响BV2细胞中TLR4的表达上调，而OGD/R作用下BV2细胞分泌的成熟IL-1β在caspase-8抑制剂干预下显著减少（由3.52±0.55降低为1.39±0.37，t=7.19，P<0.01），同时NLRP3的表达量在caspase-8抑制剂干预下显著降低（由2.79±0.23降低至1.37±0.19，t=9.37，P<0.01）。OGD/R模型中，与TLR4 siRNA转染BV2细胞共培养的RGC细胞活性为74.5%±1.2%，与经caspase-8抑制剂处理BV2细胞共培养的RGC细胞活性为62.8%±1.5%，均高于与对照BV2细胞共培养的RGC细胞活性（36.7%±0.3%），差异均有统计学意义（t=11.60，6.83；均P<0.01）。结论视网膜缺血再灌注损伤促使小胶质细胞活化，激活TLR4-caspase-8-NLRP3炎性反应小体信号通路，介导RGC死亡。（中华眼科杂志，2020，56：32-40）

简介：摘要目的探讨黄芩苷在体内急性高眼压模型及体外氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型视网膜神经节细胞（RGC）死亡中的作用及其机制。方法实验研究。取SPF级C57BL/6小鼠，通过前房灌注平衡盐溶液建立急性高眼压模型，于建模后不同时间点（分为对照组及急性高眼压后1、3、5、7 d组，每组取5只小鼠）取材评估视网膜损伤程度；同时联合荧光金上丘逆行标记RGC计数，评价尾静脉注射50 mg/kg黄芩苷对急性高眼压建模5 d时RGC损伤的作用。利用Western印迹、实时荧光定量PCR法检测小鼠急性高眼压模型视网膜炎性反应因子的表达。体外培养纯化的原代RGC，建立OGD/R模型，流式细胞术评价不同浓度（2.5、5.0、10.0 μmol/L）黄芩苷对RGC存活率的影响。建立小鼠小胶质细胞BV2细胞和原代RGC共培养体系，在OGD/R模型下，酶联免疫吸附试验检测BV2细胞炎性反应因子的分泌，评估黄芩苷对BV2细胞的作用及RGC存活的影响。采用方差分析进行统计学分析。结果在小鼠急性高眼压模型中可观察到视网膜厚度变薄，建模后3 d厚度下降至87.32%±0.94%（t=6.73，P<0.01），5 d后厚度降至74.86%±2.43%（t=13.40，P<0.01），7 d后仅为63.53%±2.15%（t=19.46，P<0.01），差异有统计学意义。荧光金上丘逆行标记RGC计数同样观察到急性高眼压建模后5 d RGC存活率下降至61.32%±5.94%（t=6.59，P<0.01），给予尾静脉注射50 mg/kg黄芩苷预处理后，RGC的存活率提高至89.93%±10.08%（t=4.84，P<0.01）。Western印迹、实时荧光定量PCR检测急性高眼压建模后炎性反应因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、诱导性一氧化氮合酶的表达，均有不同程度的增高，黄芩苷干预后炎性反应因子的表达降低。同样，在体外OGD 2 h/R 6 h后原代RGC存活率下降至51.53%±1.36%（t=14.91，P<0.01），5.0、10.0 μmol/L黄芩苷预处理后存活率提高至69.37%±7.09%、66.23%±4.25%（t=5.50，4.53；均P<0.01），差异有统计学意义。在BV2细胞和RGC共培养体系下，OGD 2 h/R 6 h后RGC的存活率为41.83%±3.55%，低于单纯RGC培养OGD 2 h/R 6 h后RGC的存活率51.33%±1.16%（t=4.96，P=0.042）；5.0 μmol/L黄芩苷预处理后，可减轻BV2细胞分泌白细胞介素1β，由（61.33±5.78）pg/ml降至（39.97±8.76）pg/ml（t=4.19，P=0.010），且与5.0 μmol/L黄芩苷预处理后单纯RGC培养（69.37%±7.09%）比，可提高RGC存活率至73.00%±5.20%（t=2.82，P=0.048）。结论体内急性高眼压模型、体外单纯OGD/R模型下，黄芩苷可直接减轻视网膜及RGC损伤，并通过抑制视网膜炎症细胞炎性反应因子的表达，发挥保护RGC的作用。（中华眼科杂志，2020，56：376-382）