景德镇及周边地区EBV相关性胃癌的临床研究

胡招兵  贾志红 刘云风 吴颖红 方年富 邱景斌

摘要：目的：探讨EBV相关性胃癌淋巴细胞浸润与肿瘤预后的相关性。方法：选取EBV阳性胃癌患者40例为实验组，并取同期非EBV相关性胃癌患者40例为对照组，比较两组肿瘤浸润淋巴细胞内的FOXP3、CD4与CD8水平，根据阳性淋巴细胞数量分为高浸润组与低浸润组，分析其和临床病理特征与预后的相关性。结果：实验组FOXP3+、CD4+与CD8+水平高于对照组（P<0.05）。EBV相关性胃癌FOXP3+与CD8+高浸润患者肿瘤浸润深度浅于低浸润患者，脉管内癌栓发生率低于低浸润组（P<0.05）。实验组低浸润患者PFS及OS均短于对照组（P<0.05）。结论：EBV相关性胃癌免疫微环境较为特殊，FOXP3+与CD8+淋巴细胞浸润会对肿瘤发展与预后产生直接影响。

关键词：胃癌；Epstein-Barr病毒；淋巴细胞；浸润；预后；相关性

EBV相关性胃癌属于胃癌的独立亚型，大部分属于富于淋巴间质的胃癌，在病灶内部会出现明显的淋巴细胞浸润[1]。肿瘤浸润淋巴细胞可反应机体自身对于肿瘤组织产生的局部免疫应答，同时也受到免疫治疗效果的影响[2]。目前并无过多关于EBV相关性胃癌淋巴细胞与预后相关性的研究[3]。本文即经本研究探究EBV相关性胃癌淋巴细胞浸润与肿瘤预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2021年1月江西省景德镇市第二人民医院肿瘤科收治的EBER-ISH检测为EBV阳性的胃癌患者40例为实验组，并取同期非EBV相关性胃癌患者40例为对照组。实验组男23例，女17例，年龄22~82（58.50±6.89）岁；对照组男25例，女15例，年龄25~83（58.66±6.90）岁。两组基本资料差异小（P>0.05）。

纳入标准：符合胃癌诊断标准[4]；术前未接受放化疗；对研究内容知情同意。

排除标准：手术治疗前行放化疗；TNM分期I期；免疫缺陷性疾病；入组前行免疫抑制治疗等患者。

1.2 研究方法

提取患者病变部位的肿瘤组织进行芯片制备，孔径/孔深/孔距分别为2.5mm/6mm/1mm，各组织芯片的最后一个孔设置为空白对照。每例患者选择2个点位，以淋巴细胞浸润的热点区域为主，排除坏死区域，保障供体蜡块组织的厚度。经EBER组织原位杂交染色试剂盒(无锡傲锐东源生物科技有限公司)、ALLSHENG原位杂交仪（杭州奥盛仪器有限公司）等按照试剂盒说明书开展EBV检测，若肿瘤细胞胞核颜色呈现为棕褐色，则为阳性。应用超敏试剂盒开展FOXP3、CD4与CD8染色，同时采用DAB显色，根据试剂盒说明书开展检测操作，阳性对照组织为扁桃体组织，以PBS代替一抗，将其作为阴性对照。FOXP3阳性细胞定位在细胞核，CD4与CD8阳性细胞定位在细胞膜。治疗方案为FOLFOX4，奥沙利铂（85mg/m2），d1；亚叶酸钙（200mg/m2），d1~2；5~氟尿嘧啶按照2000mg/m2的剂量用药，d1~2，其中0.5g以静脉推注给药，其余采用静脉泵注给药，用药时间48h，每14d重复1次，2次为1周期。同时采用静脉滴注PD-1抑制剂（上海科威制药，国药准字：H20153624，规格：5 mg/瓶）治疗，2 mg/kg，d1。21 d为1疗程，连续治疗6疗程。

1.3 结果判定

    在高倍视野下，对瘤体内的FOXP3、CD4与CD8阳性细胞的数量进行计数，取平均值，排除血管周围淋巴细胞、淋巴滤泡内淋巴细胞以及其他非淋巴细胞的阳性细胞。

1.4 统计学处理

统计学软件为SPSS25.0，在ROC曲线下对免疫细胞数量进行临界判定后，分为高浸润组与低浸润组，表示计量数据，行t检验；[n，（%）]表示计数资料，行2检验；P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 两组FOXP3+、CD4+与CD8+水平比较

实验组FOXP3+、CD4+与CD8+水平高于对照组（P<0.05），如表1。

表1 两组FOXP3+、CD4+与CD8+水平比较

组别	FOXP3+	CD4+	CD8+
对照组（n=40）	11.26±2.36	24.68±5.32	42.80±12.45
实验组（n=40）	22.68±4.60	42.85±7.18	123.68±25.80
t	13.970	12.860	17.856
P	0.001	0.001	0.001

2.2 EBV相关性胃癌患者免疫指标与临床病理特征的关系分析

EBV相关性胃癌FOXP3+与CD8+高浸润患者肿瘤浸润深度浅于低浸润患者，脉管内癌栓发生率低于低浸润组（P<0.05），如表2。

表2 EBV相关性胃癌患者免疫指标与临床病理特征的关系分析

指标	分类	例数	FOXP3+		CD4+		CD8+
			低浸润	高浸润	低浸润	高浸润	低浸润	高浸润
性别	男	23	14	11	14	11	13	18
	女	17	10	5	10	5	9	10
年龄（岁）	<60	25	15	10	12	13	13	12
	≥60	15	9	6	12	3	9	6
浸润深度	T1~T2	8	2	6	4	4	1	7
	T3~T4	32	22	10	20	12	21	11
脉管癌栓	有	25	12	13	13	12	11	14
	无	15	12	3	11	4	11	4
神经侵犯	有	20	12	8	10	10	8	12
	无	20	12	8	14	6	14	6
淋巴结转移	有	10	5	5	6	4	3	7
	无	30	19	11	18	12	19	11
TNM分期	Ⅰ+Ⅱ	14	6	8	6	8	4	10
	Ⅲ+Ⅳ	26	18	8	18	8	10	16

2.3 两组PFS及OS比较

    对照组PFS为（20.36±2.65）个月，OS为（46.85±6.89）个月；实验组低浸润患者PFS为（15.12±2.28）个月，OS为（40.32±6.77）个月，高浸润患者PFS为（19.88±2.36）个月，OS为（46.80±6.52）个月，实验组低浸润患者PFS及OS均短于对照组（P<0.05）。

3 讨论

目前临床治疗胃癌可采取手术治疗、化疗、免疫靶向治疗等众多方法。临床上在对胃癌进行治疗时，手术仍为最有效治疗方式，通过切除病变部位，可有效延长患者的生存期。同时手术治疗可使患者的生存质量得到有效提升，有利于患者的疾病预后改善。但当病灶发生转移或弥漫性扩散，则可能丧失手术治疗机会，而需借助其它方法实施治疗。因此为改善疾病预后，需对胃癌进行尽早诊治。

随着肿瘤免疫治疗受到的重视度不断提高，目前临床上在对胃癌进行治疗时，以T淋巴细胞为主的肿瘤浸润淋巴细胞受到的重视度也逐渐提高。大多数学者认为，肿瘤微环境内的CD4+辅助性T细胞，可使肿瘤抗原得到提呈，CD8+细胞毒性T细胞可使肿瘤细胞得到直接杀灭，两种免疫细胞因子均可对肿瘤治疗发挥积极的作用。对FOXP3进行表达的调节性T细胞，可发挥的免疫调节功能较为独特，可使机体免疫耐受起到维持的作用，对免疫反应产生抑制，其在EBV相关性胃癌中对于疾病预后产生的作用，在不同的研究报道中存在差异。有学者通过开展体外试验，结果显示通过将EBV阳性胃癌细胞和外周血单核细胞进行共同培养后，可增加FOXP3+T细胞的数量，使其凋亡率降低，分析EBV阳性胃癌细胞依靠对细胞因子进行分泌，从而使FOXP3+T细胞的增殖得到促进，并对其凋亡产生抑制，从而使肿瘤浸润微环境内FOXP3+T细胞的含量增加[5]。也有研究对流式细胞仪进行应用，并开展免疫组化分析，结果显示在EBV相关性胃癌中，最为主要的免疫细胞为CD8+细胞毒性T细胞。本次研究结果显示，实验组FOXP3+、CD4+与CD8+水平高于对照组，提示在EBV相关性胃癌中，容易导致间质内的FOXP3+与CD8+T细胞出现募集，从而形成具备独特性的免疫微环境。

本次研究中，EBV相关性胃癌FOXP3+与CD8+高浸润患者的肿瘤浸润深度浅于低浸润患者，脉管内癌栓发生率低于低浸润组，5年生存率高于低浸润组，与前人研究报道相符。分析原因，可能是由于CD8+细胞毒性T细胞可发挥正向调节患者机体肿瘤免疫的作用。本次研究中，实验组低浸润患者的PFS及OS均短于对照组，表明EBV相关性胃癌患者的生存周期会得以缩短，而高浸润表达的患者自身抗肿瘤免疫得到激发，同时为其实施免疫治疗，可使患者的生存期得到延长，改善其疾病预后。本次研究存在的局限性在于选取的样本量较小，后续需进一步增加样本量开展随机对照研究，分析EBV相关性胃癌的病理特点及治疗方式。

综上所述，EBV相关性胃癌免疫微环境较为特殊，FOXP3+与CD8+淋巴细胞浸润会对肿瘤发展与预后产生直接影响。

参考文献：

[1] 郭玉虹,孙燕,孙保存. 44例EBV相关性胃癌临床病理分析[J]. 天津医科大学学报,2019,25(6):634-637.

[2] 李北芳,高霞,张朦琦,等. 运用组学手段探索EBV相关性与非相关性胃癌的可能差异分子[J]. 基础医学与临床,2018,38(7):933-937.

[3] 卫美蓉,王笑峰,罗兵. lncRNA HOTAIR和H19 SNPs与胃癌及EB病毒相关胃癌遗传易感性的关系[J]. 中国病理生理杂志,2020,36(11):2030-2036.

[4] 韩璐,赵真真,王笑峰,等. TLR3和TLR4基因多态性与EBV相关胃癌易感性的关系[J]. 肿瘤防治研究,2015,42(1):14-18.

[5] 郑珂,张声,黄贞,等. 肿瘤浸润淋巴细胞与EBV相关性胃癌侵袭及预后分析[J]. 临床与实验病理学杂志,2018,34(10):1063-1068.