蒙药三春水柏枝的质量标准研究

郭继娜1，杨金山2，洪格尔2，李加拉2，姜湘英1

2巴州蒙医医院，库尔勒841000

摘要：目的 建立蒙药三春水柏枝的质量标准。方法采用TLC法鉴别没食子酸、槲皮素和异鼠李素；采用HPLC法检测槲皮素和山柰素的含量。色谱柱：Shim-pack GIST C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（55：45）；柱温：30℃；流速：1.0ml·min-1；检测波长：360nm；结果薄层色谱法对没食子酸、槲皮素和异鼠李素的鉴别专属性强，分离度好，重现性好。高效液相色谱法测定槲皮素的含量，其线性范围为1.085~17.362μg·ml-1(r=0.9989)，回收率为96.88%(RSD = 1.85%)；测定山柰素的含量，其线性范围为0.467~3.742μg·ml-1(r=0.9996)，回收率为95.37%(RSD = 1.89%)。结论该法操作简单、准确、重现性好，可以用于蒙药三春水柏枝的质量控制。

关键词：蒙药三春水柏枝；槲皮素；山柰素；薄层色谱法；高效液相色谱法

三春水柏枝Myricaria paniculata (L.) Desv.是柽柳科水柏枝属(Myricaria Desv)植物[1,2]。其嫩枝可入蒙药，名“巴勒古纳”，可清热、燥协日乌素、透疹、敛毒,主治毒热、陈热、伏热、热症扩散、肉毒症、协日乌素、血热、麻疹[3,4]。目前临床上主要用于风湿的治疗，包括风湿性关节炎、类风湿性关节炎、急慢性风湿性关节炎等[5,6]。但由于没有系统的质量控制指标体系，很难保证其质量及疗效。为了能够生产出质量可控，疗效确切安全的蒙药必须对该药进行系统的质量标准研究并制定出可靠的质量标准。本文通过对蒙药三春水柏枝中的主要药用成分——多酚类化合物和黄酮类化合物[7,8]进行研究，采用TLC法鉴别没食子酸、槲皮素和异鼠李素，采用HPLC法测定槲皮素和山柰素的含量，可以用于蒙药三春水柏枝的质量控制，并通过实验确定其稳定性，保障其质量，为起草制定质量标准提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 显微照相系统（BX51TF），仪器LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津），包括自动进样器、LC Solution色谱数据工作站以及二极管阵列检测器；数控超声波清洗器（KQ-500DE）；电子分析天平（XS205DU）；半自动薄层点样仪（LinoMAT 5），薄层照相系统（ CAMAG TLCvisualizer ）。

1.2  材料 三春水柏枝4批（由巴州燕赵蒙医院分别采集于和静县巴伦台镇、巴伦台黄庙及巴伦台沟，批号为：20230130、20230215、20230323、20230705）；对照品：槲皮素（批号:100081-201610，供含量测定用，质量分数为99.1%）、山柰素（批号:110861-202013，供含量测定用，质量分数为93.2%）、没食子酸（批号：110831-201906，供鉴别用，质量分数为91.5%）、异鼠李素（批号:110860-202012，供鉴别用，质量分数为99.1%）均购于中国食品药品检定研究院；硅胶GF254薄层板（天津思利达科技有限公司），甲醇（色谱纯，Fisher公司，美国），水为超纯水（自制），其它试剂均为分析纯。

2鉴别

三春水柏枝中没食子酸、槲皮素和异鼠李素的薄层色谱鉴别：取本品粉末1g，加80%甲醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml 使溶解，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，弃去乙醚液，水液加稀盐酸10ml，置水浴锅中加热1小时，取出，迅速冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，用水30ml 洗涤，弃去水液，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品、槲皮素对照品、异鼠李素对照品，加甲醇制成每1ml 各含1、0.5、0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述溶液各3µL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5:2:0.8）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点[9]。斑点显色清晰，专属性强，分离度好，重现性好，故列入正文。见图1。

图1. 三春水柏枝薄层色谱图（254nm）

1.槲皮素对照品；2.没食子酸对照品；3.异鼠李素对照品；4.三合一混合对照品；

5~8供试品（1号样、2号样、3号样、4号样）；

3含量测定三春水柏枝中槲皮素和山柰素含量照高效液相色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0512）[10]进行测定。方法验证如下：

3.1色谱条件的确定与系统适用性实验  填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶

，流动相为甲醇-0.1%磷酸（55:45），检测波长为360nm[11]。按槲皮素峰计算理论板数应不低于4000，供试品溶液按本品含量测定项下的方法制备。取供试品各10µL，分别注入液相色谱仪，槲皮素的理论塔板数均大于3000，分离度大于1.5，符合要求。

3.2对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品21.90mg，置于100mL量瓶，加入甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀后，作为槲皮素对照品储备液，质量浓度为217.03μg·mL-1。再精密称取山柰素对照品20.08mg，置于100mL量瓶，加入甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀后，作为山柰素对照品储备液，质量浓度为187.15μg·mL-1。精密量取两种对照品储备液各1ml至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

3.3  供试品溶液的制备 取本品粉末（过2号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4  线性关系考察精密量取槲皮素对照储备液(217.03μg·mL-1)适量，用甲醇稀释成1.085，2.170，4.340，8.681，13.021和17.362μg·mL-1等系列质量浓度的对照品溶液。按照3.1色谱条件，取系列质量浓度的对照品溶液各10μL进样，记录色谱峰的面积。以进样浓度X（μg·mL-1）对峰面积Y进行线性回归，得到线性回归方程Y=aX+b（a=41120.9，b=-16460.5，r=0.9989）。结果表明在1.085~17.362μg·mL-1范围内，槲皮素质量浓度与峰面积线性关系良好。精密量取山柰素对照储备液(187.15μg·mL-1)适量，用甲醇稀释成0.467，0.935，1.403，1.871，2.807和3.742μg·mL-1等系列质量浓度的对照品溶液。按照3.1色谱条件，取系列质量浓度的对照品溶液各10μL进样，记录色谱峰的面积。以进样浓度X（μg·mL-1）对峰面积Y进行线性回归，得到线性回归方程Y=aX+b（a=40774.7，b=-1005.22，r=0.9996）。结果表明在0.467~3.742μg·mL-1范围内，山柰素质量浓度与峰面积线性关系良好。

3.5精密度实验  精密吸取同一供试品（批号：20230130)溶液10μL，按3.1色谱条件进样，重复进样6次，测定槲皮素和山柰素的峰面积，其RSD%分别为1.58％和0.94％。表明本方法精密度良好。

3.6空白干扰实验 在3.1色谱条件下，以甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液作为空白供试品溶液。从液相色谱图可看出，空白供试品溶液与对照品溶液在相同时间无相同的保留峰，对槲皮素、山柰素的含量测定无干扰。色谱图见图2。

                  t/min

                   A

           

                 t/min

                   B

                 t/min

                  C

图2  HPLC色谱图

A．混合对照品；B．供试品；C．甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液；1.槲皮素；2.山柰素；

3.7重复性实验  取同一批样品（批号：20230130)共 6份，精密称定，按3.3项下的方法制备供试品溶液，各进样10μL，测定槲皮素和山柰素的峰面积，结果测得槲皮素平均含量为448.31μg•g-1，RSD为1.23％；山柰素平均含量为74.02μg•g-1，RSD为1.98％。表明本方法重复性良好（见表1、2)。

表1  样品重复性实验结果（槲皮素）
样品编号	称样量（g）	峰面积	含量（μg•g-1）	平均值（μg•g-1）	RSD（%）
1	0.5081	429367	446.85	448.31	1.23
2	0.5011	421848	445.16
3	0.5093	439390	456.21
4	0.5135	430718	443.55
5	0.5077	436165	454.29
6	0.5001	419734	443.82
表2  样品重复性实验结果（山柰素）
样品编号	称样量（g）	峰面积	含量（μg•g-1）	平均值（μg•g-1）	RSD（%）
1	0.5081	72271	75.85	74.02	1.98
2	0.5011	69106	73.54
3	0.5093	72389	75.79
4	0.5135	70301	73.01
5	0.5077	70062	73.59
6	0.5001	67829	72.33

3.8加样回收率实验  取已知含量的样品（批号：20230130）9份，分别精密加入一定质量浓度的槲皮素对照品溶液（202.41μg·mL-1）和山柰素对照品溶液

（45.28μg·mL-1）各1.0mL，按供试品项下方法操作，制备供试品溶液，按色谱条件分别进样10μL测定，计算加样回收率。结果见表3。

表3  槲皮素和山柰素加样回收率测定结果（n=9）
成分	称样量（g）	样品含量（μg）	对照品加入量（μg）	测得量（μg）	回收率（%）	平均回收率（%）	RSD（%）
槲皮素	0.5064	226.09	202.41	421.88	96.73	96.88	1.85
	0.5011	223.73	202.41	424.09	98.99
	0.5056	225.74	202.41	416.73	94.36
	0.5027	224.44	202.41	421.00	97.11
	0.5071	226.41	202.41	427.13	99.17
	0.5024	224.31	202.41	424.08	98.70
	0.5070	226.36	202.41	418.60	94.98
	0.5065	226.14	202.41	421.54	96.54
	0.5080	226.81	202.41	419.76	95.33
山柰素	0.5064	37.48	45.28	80.70	95.45	95.37	1.89
	0.5011	37.09	45.28	81.00	96.97
	0.5056	37.42	45.28	79.87	93.75
	0.5027	37.21	45.28	80.81	96.29
	0.5071	37.54	45.28	82.32	98.90
	0.5024	37.19	45.28	80.28	95.16
	0.5070	37.53	45.28	79.84	93.44
	0.5065	37.49	45.28	80.45	94.88
	0.5080	37.60	45.28	79.94	93.51

3.9供试品稳定性实验  将在室温下放置的同一瓶供试品溶液（批号：20230130)，在上述色谱条件下分别在0、4、8、12、16和24h的时间点进样测定，按槲皮素和山柰素的峰面积积分值，计算RSD值分别为1.16％和1.81％，显示供试品溶液在室温24h内稳定。

3.10样品的测定    取4批样品，按3.3项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别取供试品溶液和混合对照品溶液各10μL 进样，记录峰面积，按外标法计算样品的含量，结果见表4。

表4   样品含量测定结果（按干燥品计）μg•g-1
批号	槲皮素	山柰素	槲皮素与山柰素含量之和
20230130	446.48	74.03	520.51
20230215	324.01	188.98	512.99
20230323	261.14	41.91	303.05
20230705	272.81	29.38	302.19

4讨论

4.1薄层色谱法鉴别没食子酸、槲皮素和异鼠李素，为了确保样品中各成分提取的完全，使各成分斑点能同时显现且区分清晰，对比了仅用甲醇回流提取和甲醇回流加乙醚、乙酸乙酯萃取的提取方法，并使用了展开剂甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10：5：0.5）、甲苯-甲酸乙酯-甲酸（15：5：0.1）、（5：2：0.8）、（10：5：0.5）等不同比例，实验结果表明，甲醇回流加乙醚、乙酸乙酯萃取的提取方法，各成分提取最完全，用甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5：2：0.8）比例最理想，三个成分斑点清晰，且无干扰斑点。

4.2在考察供试品提取条件时，考察了分别用甲醇、50%甲醇、甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液作为溶剂，分别用超声处理（30min、1h）、加热回流处理（30min、1h）、70℃回流处理（30min、1h）等提取方式，实验结果证明，用甲醇-25%盐酸溶液（4:1）混合溶液作为溶剂，加热回流1h的提取方式提取效果最快，操作简便。

在流动相的选择过程中，除了采用含量测定项下的流动相，还分别用乙腈-0.1%磷酸溶液（5:95）、甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）的等度洗脱来考察了槲皮素和山柰素两种成分的测定结果，实验结果表明，含量测定项下的流动相是测定三春水柏枝中槲皮素和山柰素含量的较为理想的流动相，指标成分峰形良好，能满足分析要求。本实验还考察了柱长分别为150mm与250mm的Waters Symmetry C18以及Agilent SB-C18色谱柱的分离效果，结果显示三种色谱柱的分离效果都很好。

4.3除了薄层色谱鉴别实验和高效液相色谱含量测定实验，本研究还通过显微鉴别对三春水柏枝的显微特征进行定性分析，并依据《中国药典》2020年版四部通则对三春水柏枝中水分、总灰分、酸不溶性灰分以及浸出物的含量进行测定，结果表明这四批样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物的含量均比较接近，为建立可控的质量标准提供依据。

4.4综上所述，本研究所建立的标准可行、重复性好、专属性强，可用于三春水柏枝的质量控制，将进一步对本品的质量标准进行研究和完善。

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