串联质谱技术联合高通量测序对新生儿遗传代谢病的筛查研究

蔡芳1蒋林通讯作者

通讯作者：郴州市第一人民医院新生儿科（湖南省郴州市  423000）

摘要：目的：观察新生儿遗传代谢病应用串联质谱技术联合高通量测序的筛查效果。方法：选取2022年6月～2023年6月于我院出生的60例疑似遗传代谢病的新生儿，对所有患儿均实施串联质谱技术筛查，依据筛查阳性结果，实施联合高通量测序。结果：60例疑似遗传代谢病的患儿中，经单纯串联质谱筛查分析发现阳性17例，氨基酸、脂肪酸、有机酸类疾病分别为8例、4例和5例。联合高通量测序，发现有13例患儿为阳性，4例患儿为阴性，串联质谱技术联合高通量测序的符合率76.47%。结论：对新生儿遗传代谢疾病筛查时应用串联质谱技术联合高通量测序，能够有效提高筛查准确率，可于临床推广。

关键词：串联质谱技术；高通量测序；遗传代谢病

现阶段，新生儿遗传代谢疾病发生率不断上升[1]。遗传代谢疾病，是在基因突变影响下，造成的机体代谢紊乱，会引发系列临床症状或疾病。若未及时确诊并制定治疗方案，将会危及患儿的生命安全。串联质谱技术在新生儿遗传代谢疾病中的应用，安全性较高，检测快速，不过能够检测出的疾病种类有限[2]。为明确串联质谱技术联合高通量测序在新生儿遗传代谢病的应用效果，本研究展开探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2022年6月～2023年6月于我院出生的60例疑似遗传代谢病的新生儿，将其作为本次研究对象展开探讨。上述入选新生儿中，出生日龄最短2d，最长10d，日龄平均值（6.23±0.42）d；胎龄最小33周，胎龄最大41周，胎龄平均值（37.85±1.26）周；出生体重最小2.26kg，最大4.56kg，出生体重平均值（3.41±0.65）kg。60例疑似遗传代谢病的新生儿中有15例患儿出现不明原因的慢性腹泻，有13例患儿出现不明原因的拒乳，有8例患儿出现不明原因的胆汁淤积，有10例患儿出现不明原因的黄疸，有5例患儿出现不明原因的电解质紊乱，有7例患儿出现不明原因的多器官功能紊乱。纳入标准：（1）入选对象均为新生儿；（2）入选对象家属均认可本次研究；（3）本研究经过院内伦理委员会批准。排除标准：（1）合并先天性心脏病、肝肾功能障碍的患儿；（2）与纳入标准不符的患儿；（3）资料丢失或不全的患儿。

1.2方法

对所有患儿均实施串联质谱技术联合高通量测序，依据《新生儿疾病筛查技术规范》，采集患儿的足跟血，采血时间至少为患儿出生3d后，且接受过至少6次哺乳。在对患儿足跟血采集时，要将血液滴到滤纸片上，使血液自然渗透。每个单独的滤纸片上，至少要采集3个直径为0.8mm的血斑，经过自然晾干，将其密封于样品袋中，放置到2℃至8℃的环境中保存。串联质谱法的检测方法：选择型号为XEVO-TQD的串联质谱仪（美国Waters公司生产），非衍生化多种氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱的检测试剂盒及其配套试剂（芬兰WallacOy公司生产），新生儿筛查血斑质控品（杭州杰毅迈特医疗公司）。复溶氨基酸、酰基肉碱内标试剂，对内标工作液加以配制。对质控品、样品打孔，选择的打孔器直径是3.2mm，在U型底96孔微孔板中置入打出的血斑，每个孔都放置1个血斑。将100μl的内标工作液加入到孔中，封膜。随后将其置入到震荡器内，于温度45℃且650rpm的环境中，震荡孵育至少40min。在吸取75μl萃取液以后，将其转移到V型的底检测板内，以铝箔封板。静置120min，上机检测。若筛查结果与参考截断值相比，明显更高，要将新生儿召回复查，对筛查后呈阳性的疑似患儿再次筛查，实施基因诊断。采集患儿2ml外周血，将其置于EDTA抗凝管中，经检测提取基因组DNA，由超声波建库，测序时以型号DNBSEQ-T7的基因测序仪为主，利用生物信息学分析，对基因致病性变异情况加以筛查。

1.3统计学处理

本次研究中，对涉及到的数据采用SPSS20.0统计软件处理。计数资料以（%）表示，计量资料使用t对检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1串联质谱检测结果

60例疑似遗传代谢病的患儿中，经单纯串联质谱筛查分析发现阳性17例，氨基酸、脂肪酸、有机酸类疾病分别为8例、4例和5例。

表1 串联质谱检测结果分析

疾病类型		例数	筛查数值
氨基酸类疾病（n=8）	PKU	4	Phe=404.28、353.95、874.36
	NICCD	1	Git=52.14
	CTLN1	1	Git=218.74
	CTLN2	1	Git=316.57
	组氨酸血症	1	His=288.26
脂肪酸类疾病（n=4）	PCD	2	C0=6.28、7.26
	MCADD	1	C6=0.84、C6DC=0.30
	β-酮硫解酶缺乏症	1	C3DC+C4OH=1.36
有机酸类疾病（n=5）	GA-1	2	C5DC+C6OH=3.68、3.93
	MMA	2	C3=8.57，C3/C2=0.84
	PA	1	C3=31.17、C3/C2=1.13

2.2串联质谱技术联合高通量测序结果

17例经串联质朴技术筛查为阳性的患儿，联合高通量测序，发现有13例患儿为阳性，4例患儿为阴性，串联质谱技术联合高通量测序的符合率76.47%。

表2 串联质谱技术联合高通量测序结果分析

疾病类型		例数	致病基因
氨基酸类疾病（n=6）	PKU	2	PAH、AHCY
	NICCD	1	SLC25A13
	CTLN1	1	ASS1
	CTLN2	1	ASS2
	组氨酸血症	1	HAL
脂肪酸类疾病（n=3）	PCD	1	SLC22A5
	MCADD	1	ACADM
	β-酮硫解酶缺乏症	1	ACAT1
有机酸类疾病（n=4）	GA-1	1	GCDH
	MMA	2	MMACHC、MUT
	PA	1	PCCA

3 讨论

在临床中，新生儿遗传代谢疾病是新生儿科常见病。该疾病早期的临床表现并无典型特征，筛查及干预的难度较大，致死率高[3-4]。结合新生儿的症状表现，对其实施早期筛查，可有效实现对新生儿出生缺陷的预防。现阶段，串联质谱技术是比较常用的新生儿遗传代谢疾病筛查手段。该技术筛查时，可对脂肪酸、有机酸及氨基酸等代谢疾病展开筛查[5-6]。但受多种因素影响，该技术筛查时涉及到的指标和比率较多，临床判断难度较大。随着医学技术的更新和发展，高通量测序逐渐受到临床的重视[7-8]。本研究结果显示，在疑似的60例新生儿遗传代谢疾病患儿中，初筛阳性患儿有17例，说明该疾病需要引起临床重视。在此基础上，对初筛阳性的患儿实施联合高通量测序，结果显示有13例患儿为阳性，符合率高达76.47%。在高通量测序下，对单纯串联质谱技术的检测结果加以纠正。分析其误诊的原因，可能与机体代谢紊乱有关，导致相关标志性代谢物出现异常。高通量测序检查方式下，其所涵盖的疾病谱广泛，能够在早期筛查新生儿遗传代谢疾病。

综上所述，对新生儿遗传代谢疾病筛查时应用串联质谱技术联合高通量测序，能够有效提高筛查准确率，可于临床推广。

参考文献：

[1]谭举方，朱晓芳，周艳玲，等.高效液相串联质谱技术在新生儿遗传代谢病早期筛查中的应用价值分析[J].中国妇幼保健，2022，29(005):037.

[2]张旻，刘晓燕，凌振威，等.串联质谱技术在河源地区新生儿遗传代谢性疾病筛查中的临床应用价值分析[J].当代医药论丛，2023，21(2):78-81.

[3]皮双双，熊月娥，王力，等.串联质谱与高通量测序技术联合检测在新生儿疾病筛查中的应用价值[J].当代护士:下旬刊，2023，30(3):157-160.

[4]郑国兵，梁睿，唐家彦，等.串联质谱技术在新生儿遗传代谢病筛查中的应用分析[J].分子诊断与治疗杂志，2021，13(11):1809-1812.

[5]陆齐泉，罗绮莉，宁立芬.串联质谱法在新生儿遗传代谢疾病筛查中的临床应用价值分析[J].医药前沿，2021，11(16):85-86.

[6]Hooshfar S , Tchu S , Yun C ,et al.Development of a high-throughput differential mobility separation-tandem mass spectrometry (DMS-MS/MS) method for clinical urine drug testing[J].Journal of mass spectrometry and advances in the clinical lab, 2022, 23:50-57.

[7]Hirasawa T , Kikuchi M , Shigeta K ,et al.High-throughput liquid chromatography/electrospray ionization–tandem mass spectrometry method using in-source collision-induced dissociation for simultaneous quantification of imatinib, dasatinib, bosutinib, nilotinib, and ibrutinib in human plasma[J].Biomedical Chromatography, 2021, 35.

[8]Hou M , Shi Y , Cai Y .Determination of 16 organophosphate esters in human blood by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with liquid-liquid extraction and solid phase extraction[J].Chinese Journal of Chromatography, 2022, 39(1):69-76.

作者简介：第一作者：蔡芳，硕士，副主任医师，研究方向：儿童神经内科，遗传代谢性疾病，抽动症，单位郴州市第一人民医院儿童神经内科。

通讯作者：蒋林，硕士，副主任医师，研究方向：新生儿疾病，遗传代谢性疾病。单位郴州市第一人民医院新生儿科

课题编号：ZDYF2020054 《郴州市科学技术局科技创新能力培育计划》