C反应蛋白检测方法的研究进展

陆炜高 ,廖彬,温百慧 ,屈庆群

摘要：C－反应蛋白作为一种急性相反应蛋白，本文从C－反应蛋白的发现到现在临床上的大量运用，回顾了C反应蛋白生物学特性和过去的检测方法，作重介绍了现代检测方法的原理、优缺点和灵敏度，对C－反应蛋白的检测法进行了较好的总结和概括。

关键词：C－反应蛋白  散射比浊法  免疫透射比浊法  免疫荧光双抗体夹心法  ELISA法

 1  C－反应蛋白简介

 1.1 C－反应蛋白的发现

C－反应蛋白（C-neactveprotein,简称CRP）.Tillet和Rancis在1930年在美国的一家研究所里发现了一种能与肺炎球菌C多糖体反应形成复合物。1941年科学家们对其仔细研究后发现它出现于急性感染时的蛋白。正式命名为C－反应蛋白，并得到了广泛的应用。
1.2 C－反应蛋白的生物学结构及特性

CRP是一种环状五聚体蛋白，由五个亚单位组成，每个亚单位含206个氨基酸残基，分子量为23017，半衰期为19H。CRP表现出多种多样的生物学活性，其中主要包括对炎症反应的防御、调节作用、对炎症的吞噬反应等。另外，C－反应蛋白还可和细胞核抗原、凋亡细胞相结合，与免疫反应相关。有研究表明，超敏C反应蛋白有趋化单核细胞的作用，以此来产生组织因子，从而使补体系统激活，所以，C－反应蛋白在免疫疾病方面也有着极其重要的参考价值。

1.3  C－反应蛋白的研究

现代研究认为：C反应蛋白是由肝脏合成的因一系列感染或炎症因素刺激而产生的急性时相反应蛋白，在机体发生炎症、感染、心肌梗死及肿瘤等情况下，血浆浓度发生显著变化的一类蛋白质。在正常情况下含量极低, 但在炎症开始后6H内即可检测得到。所以说CRP在感染时是极好的指标。长期以来,临床医生们使用白细胞(WBC)计数及分类作为临床感染检测的常规指标,但缺陷是：有相当部分的被细菌感染的患儿WBC计数及分类指标变化很不明显。随着研究的深入和检测方法的改进，检测得更为细致的超敏C反应蛋白的出现了，这就为感染时的快速诊断又提供了一个参考指标。相当大的程度上填补了WBC计数及分类指标的不足，因为在急性炎症状态下，C反应蛋白的浓度上升很高，可达上限的500倍[1]，作为一个极灵敏的指标，很容易被检测出来，但是，假如是慢性炎症，C反应蛋白的浓度变化很小，于是，检测得更为精准的方法的出现成为必然，即超敏C反应蛋白（hs-CRP）的检测出现了。

2检测方法

主要分为非免疫标记技术和免疫标记技术这两类，其原理都是制备CRP单克隆抗体，与待测标本中的C－反应蛋白发生抗原抗体反应。区别在于标记和未标记。由于C－反应蛋白 在血液中浓度较为稳定，溯源性较强，于是更先进的技术，如标记技术，胶乳增强技术出现了。发展到现在，C反应蛋白的检测方法有非常多，随着标准化的建立，C－反应蛋白的测定成为一种高准确度、快速灵敏的检测方法。

2.1 非免疫标记技术

在过去，实验室大都采用免疫扩散和免疫电泳法检测C－反应蛋白，根据免疫沉淀环直径、凝集程度或呈色反应，从而计算出血清中的CRP含量。这些方法较为粗略，可在感染较为严重时检测到CRP，灵敏度一般大于l0mg/L。但随着胶乳增强技术的应用，大幅度提高了灵敏度。

胶乳凝集法

胶乳凝集法属于非免疫标记技术。分为试管法与玻片法。试管法先将受检者的标本在试管中作倍比稀释，再加入人工致敏的胶乳试剂，直接观察凝集结果。而玻片法操作则更为简便，把受检标本和人工致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动后即可观察结果。有颗粒凝集的为阳性反应，阴性反应为保持均匀乳液状。因为胶乳是人工合成的，因此其性能比红细胞稳定，均一性好。但反应性较红细胞稍差。

散射比浊法

散射比浊法是根据待验CRP在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。加入抗人CRP抗体时，待测样品中的CPR可与这发生特异的抗原抗体反应，形成复合物，检测通道的光源发出的光通过复合物时发生散射，散射光的强度与生成的复合物的量成正比，通过检测吸光度的变化来确定CRP的含量。与标准曲线对比后计算出具体数值。在急性胰腺炎早期，此法与免疫透射比浊法符合度较高，也说明了这两种方法的灵敏度较为一致[2]。

免疫透射比浊法

免疫透射比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：加入抗人CRP抗体于胶体颗粒上，可与待测样品中的CPR特异的抗原抗体反应，反应完成后，由光源发出的光通过复合物时发生透射，通过检测吸光度的变化来确定CRP的含量[3]。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出样品中抗原的含量。

2.2 免疫标记技术

近些年，人们把另外一种精准的检测技术应用于CRP的检测，即免疫标记技术，比如放射免疫测定方法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫发光法等，其标记物有荧光素，酶联标记物（常用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）等，更好地提升了CRP的检测灵敏度和准确度。

2.3免疫荧光双抗体夹心法

2.3.1将含有已知抗体（多为人工制成）的抗血清吸附在小孔里，洗涤一次；

2.3.2加待测抗原，如为特异的，则发生特异性结合，洗涤，目的是把多余抗体洗除；

2.3.3加入荧光抗体，使其和待测抗原呈特异反应，形成双抗体夹心；

2.3.4加入该荧光抗体的底物，若显色，则说明在血清中存在相应的抗原。

2.4 ELISA法

2.4.1 其原理是在试剂中使用两种抗体与CRP分子上不同抗 原决定簇发生反应。即用抗人CRP单克隆抗体包被微孔板，加入待测样本，再加入酶标记多克隆抗体，特异性地形成“固相抗体-抗原-酶标记抗体”的复合物，洗去未结合物后，加入底物呈色，呈色的强度与检测样品中一定范围内的CRP浓度成正比。

现在我们普遍采用的方法是散射比浊法、免疫透射比浊法、免疫荧光双抗体夹心法、ELISA法，其中散射比浊法、免疫透射比浊法虽为非免疫标记技术，但近年人们采用了胶乳增强技术，使得灵敏度大幅提高。

免疫荧光双抗体夹心法定量检测全血，血浆或血清样本中的超敏C-反应蛋白和常规C-反应蛋白的浓度。比如，我们在测试孔加入待测样本后，样本中的C-反应蛋白抗原和抗体结合形成反应复合物，再加入C-反应蛋白荧光抗体，形成荧光抗体-抗原-抗体的复合物。如果血液中的C-反应蛋白越多，形成的复合物就越多，荧光抗体的信号强度能够反应血清中C-反应蛋白数量，通过免疫荧光检测仪，可检测出血液样本中C-反应蛋白的浓度。

3方法学评价

3.1免疫扩散法和免疫电泳法用来检测C反应蛋白则操作较为烦琐，且灵敏度较低，大多检验工作者已不采用。

    3.2假阳性：血清中存在类似的抗原抗体所形成的反应，即假反应，或者血液的某些成分与C反应蛋白有相似的抗原决定簇。

3.3假阴性：血清中的某些成分阻拦了抗原决定簇，使C反应蛋白无法与特异的抗体相结合，或者标本放置过久，CRP抗原退化而无法被识别。

3.4检验方法的优点和灵敏度：

3.4.1免疫扩散法和免疫电泳法灵敏度较低，操作烦琐。

3.4.2免疫透射比浊法 散射比浊法，免疫荧光双抗体夹心法和ELISA等方法用来检测C应应蛋白，因操作简便，灵敏度高，为大多检验工作者所采用。近年来，采用乳胶增强散射比浊或免疫透射比浊技术，使得CRP的检测能力提高到0.1-0.01mg/L，而ELISA方法甚至可以检测低限为0.007mg/L浓度的CRP。

3.4.3散射比浊法采用特定蛋白分析仪操作，每次只能测定1份标本，但操作简单快速，适于急诊检验。

3.4.4免疫透射比浊法采用全自动生化分析仪操作，其批量检测较散射比浊法快速简便，显示了该方法批量检测的优越性，提高了工作效率。

。

常用方法比较表

项目	免疫扩散法	散射比浊法	免疫透射比浊法	ELISA法
灵敏度	大于l0mg/L	0.1-0.01 mg/L	0.1-0.01 mg/L	0.007 mg/L
操作性	手工、较烦琐	手工、烦琐	全自动、便捷	全自动、便捷

4临床意义

4.1常用于细菌和病毒感染的鉴别诊断：炎症时,CRP水平立即升高,而病毒性感染下的CRP大都正常.脓毒血症CRP急剧升高,但假如我们进行血培养，所需时间大大延长。又如，在检测细菌性脑膜炎中，CRP有极大的优势，它的阳性率达到99％。
     4.2 CRP的预警作用：炎症中，在患者疾病发作时,CRP的升高要早于WBC，,疾病恢复时，CRP的回复也很快，故而具有极高的参考价值。

4.3其它方面，王昆等[4]提示了急性脑血管病患者中的血液CRP浓度明显增高与神经功能缺损程度存在正相关，提示我们它还可以做为判定患者神经功能缺损病情方面的轻重指标。

4.4 最近的研究发现，CRP通过与细胞表面Fc7受体的结合而与免疫细胞产生相互作用，因此可能在天然免疫系统和获得性免疫系统间架起了桥梁，从而提供了早期、有效的抗原抗体反应[5]。这是CRP对机体防御反应的主要机制之一。

4.5 采用全自动血液分析仪检测C反应蛋白,能够具有较强的重复性,且检测的精准度较高,且稳定性较强,需要检测的血液量较少,能够快速取得检验结果,在临床上的应用价值较高[6]

     4.6 高频超声联合CRP诊断小儿阑尾炎,诊断准确率、灵敏度均较高,能有效降低漏诊

 率,有助于临床及时诊断治疗[7]。 

    4.7 将来,由于检测技术的更新,测定CRP的更快速、简便和可靠的方法迅速建立CRP 

在临床应用领域大大增加.其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。最近的研究显示：C反应蛋白检测在恶性肿瘤患者、有效鉴别小儿肺炎感染类型的诊断中具有确切的提示效[8] [9]。

                       参考文献

[1]全国卫生专业技术资格考试用书编写专家委员会．临床医学检验技术[M]．人民卫生出版社，2016，11（1）：310-310．

[2]田学昌,刘吉盛,曲畅,张学平. 联合检验血清淀粉酶、脂肪酶与C反应蛋白在急性胰腺炎早期诊断中价值

[J]. 现代仪器与医疗,2015,(02):76-78.

[3]彭凤,徐晓萍,王琳,应春妹. 免疫透射比浊法和免疫散射比浊法检测特定蛋白的抗干扰能力比较[J]. 检验医学,2013,(02):142-145.

[4]王坤,王文明,盛玉国,荆秀荣,陈刚,李乃选,段新武. 超敏C反应蛋白在短暂性脑缺血发作患者临床转归中的应用[J]. 当代医学,2011,(22):14-15.

[5]张华俐,王超,张蕊,张健,范蓉. 发光免疫分析仪联合检测超敏C反应蛋白、降钙素原及免疫功能对小儿肺炎诊断的价值[J]. 中国医学装备,2016,(12):109-112.

[6]王昊.全自动血液分析仪检测C反应蛋白的性能分析[J].中国医疗器械信息,2021,27(06):62-63.DOI:10.15971/j.cnki.cmdi.2021.06.030.

[7]王浡.高频超声联合CRP检测在小儿阑尾炎中的诊断价值[J].临床研究,2021,29(01):134-136.

[8]李茂林,蒋秀园,薛军浩.恶性肿瘤患者血清超敏C反应蛋白检测的临床价值[J].临床医药文献电子杂志,2020,7(38):127.DOI:10.16281/j.cnki.jocml.2020.38.110.

[9]刘颖,田永波,陈富菊,余益萍,侯德禄.C反应蛋白检测在鉴别小儿肺炎感染类型中的诊断价值[J].心理月刊,2019,14(11):178.DOI:10.19738/j.cnki.psy.2019.11.148.