术中快速免疫组化在病理诊断中的应用价值

李雪娇

摘要：术中冷冻切片HE染色已广泛应用于临床手术中快速诊断，然而，由于某些肿瘤细胞在HE染色组织形态学上的相似性，该方法易漏诊、误诊，甚至造成患者二次手术或医疗事故。石蜡切片免疫组化染色是病理工作中重要的检测手段之一，但其染色时间长，无法在术中及时提供诊断结果。而术中冷冻切片HE染色结合快速免疫组化染色可大幅提高术中快速病理诊断的准确性。本文从术中快速免疫组化技术的发展史、应用场景、技术要点和优缺点等多方面阐述了此技术在病理诊断中的应用价值。

关键词：术中快速免疫组化、冷冻切片、病理诊断

冷冻切片HE染色技术早已普遍用于解决手术中的快速诊断问题，该染色技术一般在30min左右即可对送检组织做出快速的病理诊断，而HE染色主要是在光学显微镜下观察病变细胞的形态学变化及特点来判断病变的性质及具体类型。因此，对于一些形态学表现不太典型的病例，术中病理诊断难度就很大。随着医学科学的高速发展，各种新的肿瘤诊断方法不断涌现，特别是在肿瘤的诊断、鉴别诊断中起很大作用的免疫组化技术的应用，解决了病理诊断中的许多难题，使诊断病理学水平明显提高。

在临床病理诊断中，免疫组化技术是一种重要的技术和手段，从20世纪70年代开始，该技术就应用于病理诊断。它是根据抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应，使标记了抗体的显色剂显色，从分子水平上检测细胞中的抗原，对抗原进行定位、定性和定量的检测[1]。该技术可用于恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断，确定转移性肿瘤的原发部位或者对肿瘤进行进一步的病理分型，以及发现微小的转移灶等。但由于常规免疫组化步骤繁琐、耗时长，一般需要24-48小时，不能用于术中快速病理诊断。后来，丹麦DAKO公司推出的EPOS（Enhanced polymer one-step staining）法，原理是采用一种具有惰性的多聚化合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体和HRP（辣根过氧化物酶）结合在一起，形成HRP—多聚化合物—特异性抗体巨大复合物，该聚合物分子量大，与一抗结合位点多，使一抗直接与组织中的特异性抗原结合增加，最后有充足的HRP与DAB发生显色反应，反应迅速，这为免疫组化染色精简了步骤，缩短了时间[2]。如今，随着免疫组化技术的不断改进和标准化试剂盒的出现使免疫组化染色的质量不断提高，染色时间大大缩短，使术中快速免疫组化染色成为了可能。

已有相关研究证实，术中快速免疫组化可以协助诊断一些不明确的或疑难的病例，明显提高诊断结果的准确率，有效防止漏诊和误诊事故的发生[3]，如对前哨淋巴结内癌的微转移、低分化癌与肉瘤、硬化性肺细胞瘤与肺腺癌[4]、乳腺硬化性腺病与乳腺浸润性癌[5]等的鉴别诊断。而病理技术员在操作术中快速免疫组化时应注意以下技术要点：（1）固定液的选择:一般冷丙酮固定的冷冻切片显色效果优于AAF固定液，因为冷丙酮具有更强的渗透性和抗原保护作用。其次，丙酮挥发快，切片经其固定后不需用PBS溶液冲洗，不光可以节省时间，还可提高一抗的孵育浓度[6]；（2）免疫组化染色时，要注意抗体的浓度和孵育温度，在滴加抗体前要彻底甩干切片，保证抗体浓度不被稀释，并在孵育过程中保持温度恒定在37℃左右；（3）一抗浓度需高于常规石蜡切片的一抗浓度，根据检测指标表达的不同，快速免疫组化一抗浓度甚至要达到常规使用浓度的5～10倍；（4）滴加试剂的量以完全覆盖切片的组织为宜，一般需要150～200μL；（5）购入的新抗体或不同批次的抗体，在使用前需进行预实验来确定最佳固定液及抗体浓度，确保染色效果最佳。

术中快速免疫组化技术相较于常规免疫组化具有显著优点，比如操作简便，节省时间，而且从保存抗原角度来看，冷冻切片比石蜡切片更有优势，不需要进行抗原修复，抗原保存的完整度更好[7]。在日常的术中快速病理诊断过程中，诊断医师可以根据组织来源并结合HE染色结果中的形态表现，挑选1～2种抗体进行术中快速免疫组化染色，不需要准备特殊的抗体及其它化学试剂和设备，整个染色过程仅需15min即可，完全满足术中快速病理诊断的时间要求。

虽然通过术中对冷冻切片进行快速免疫组化染色可提高术中快速病理诊断的准确性，但术中快速免疫组化技术也存在相应缺陷[8]：术中冷冻组织由于未经脱水、浸蜡等步骤，各组织成分软硬程度不一，影响切片完整度；切片过程中由于缓慢冻结或者冷冻时间过长等原因，易造成组织细胞内外冰晶及核内冰晶的产生，进而导致抗原弥散，影响阳性定位和后续判读；有些组织的冷冻制片本身就有难度，如果行快速免疫组化则需花费更长的时间，就失去了快速诊断的意义。另外，快速免疫组化在切片固定、操作流程等方面缺少统一标准，部分抗体结果的可靠性有待商榷等，这些都可能造成染色结果的不确定性。

总之，术中快速免疫组化技术无疑在某种程度上解决了部分诊断的难题，但这也对病理技术员的操作技能提出更高的要求，同时要求试剂的技术和质量达到更高的标准。如果试剂的质量不稳定或者质量太差，所制作出的切片将缺乏参考意义，不但解决不了诊断问题，还可能给诊断带来更多的干扰，就失去了其应用价值。所以要想让术中免疫组化技术在术中快速病理诊断中得到更好的应用，必须要以试剂质量和技术员的制片技术作为保障。随着病理技术的飞速发展，术中快速免疫组化技术已日趋成熟，有望在协助术中快速病理诊断中得到广泛应用。

参考文献：

[1]马改玲.质量控制对免疫组化病理技术制片质量的影响[J].临床研究,2022,30(05):5-8.

[2]谢丽微,周伶俐,王宗敏.冷冻切片免疫组织化学技术的应用体会[J].临床与实验病理学杂志,2007,(01):91-92.

[3] BRAJKOVIC S, DUPOUY D G, DE LEVAL L, et al. Microfluidics for rapid cytokeratin immunohistochemical staining in frozen sections［J］.Lab Invest,2017,97(8):983-991.

[4]沈元龙,李琳,吴子豪.术中冰冻切片快速免疫组化 HE染色技术诊断硬化性肺细胞瘤和肺腺癌的应用对比[J].安徽医学,2019,40(12):1392-1395.

[5] 张星.冰冻切片病理诊断法诊断乳腺硬化性腺病的准确性分析[J].首都食品与医药,2019,26(13):12.

[6] 胡锦林,王灿铭,郭振英.固定液对冷冻切片质量的影响[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(06):706-707.

[7]马国荣.浅谈快速免疫组化在冷冻中应用的利弊[J].诊断病理学杂志,2018,25(06):471,476.

[8]高少阳,王明伟,张盛,岳君秋,常青.建立优化的术中快速免疫组化检测体系[J].临床与实验病理学杂志,2021,37(01):108-109.