离子交换层析技术在血液制品分离纯化中的应用

李勇1,毕晓峰2,郑皓仁1,吴桂春1,孙振宇2*

摘要  离子交换层析技术因其反应条件温和易保持蛋白质天然构象已广泛应用于血液制品的制备，目前大多采用将低温乙醇蛋白分离法与离子交换层析工艺相结合制备工艺。本文介绍了离子交换层析技术在血液制品中的应用，并比较了传统法与离子交换层析法制备方式的区别。层析法自动化程度高、批次质量稳定性好，更具有规模化生产推广意义。

关键词血液制品；离子交换层析；分离提纯

1 背景

血液制品特指血浆蛋白制品和相应的重组制品，是由健康人血浆或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制备的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分的统称。血液制品主要分为白蛋白类、免疫球蛋白类、凝血因子类和微量蛋白制品等不同种类[1]。20世纪40年代，由Cohn采用的低温乙醇法分离纯化血液制品，是世界血浆蛋白分离规模化生产的基础。但是随着科技的进步以及社会多元化的需求，仅依靠原有分离技术获得的产品已经很难满足社会需要，因此血液制品的分离纯化技术亟需变革。由于组成蛋白质的氨基酸种类和数量不同，因此不同的蛋白质有不同的等电点，这就为血液制品的提纯分离提供了新方法，即离子交换层析法。其原理是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。从根本上改变了原有技术分离时间长、步骤繁琐、分离效果差、产品种类少、自动化程度低等缺点，有效地提高了原料血浆的利用率及使用安全性，丰富了产品的种类[2]。

2离子交换层析技术在血液制品中的应用

2.1人血白蛋白

人血白蛋白(human serum albumin, HSA)是人体血浆蛋白之中含量最多的蛋白质（约占60%左右），是最早从血浆中分离出的一类蛋白，并作为血浆扩容剂广泛应用于临床治疗中。以Cohn法和Kistler法为主的低温乙醇工艺是目前使用最多的HSA制备方法，但分离步骤多、分离周期长、工艺复杂且全程要求低温环境，并且制品纯度不高。早在1993年，Yap等[3]研究发现低温乙醇结合离子交换层析技术从组分II、III上清液提取的HSA纯度可达99.5%，远高于单纯采用低温乙醇法制备的90%。我国大多企业仍然沿用传统的低温乙醇工艺，但是经常会遇到制品纯度低、多聚体和热原含量高等问题。因此近年来，许多厂家[4-6]也对此进行了改进，研究结果(表1)表明增加层析步骤制备的HSA纯度更高、杂蛋白含量更低、临床使用安全性更好。研究人员还发现层析法可有效去除HSA制品中的热原、多聚体和杂蛋白含量，进而提高产品的质量[7,8]。

表1 HSA层析法成品检定结果

厂家	标准	纯度（%）	标准	多聚体（%）	原料
北京生物所	≥96%	99.9	≤5%	0	组分II+III上清液
山东泰邦		99.4		0.5	组分IV上清液
成都生物所		99.1		1.3	组分IV上清液

2.2人免疫球蛋白

在血浆中，免疫球蛋白是除白蛋白外含量丰富的一类蛋白,约占血浆蛋白总量的12％～15％。其中以静脉注射用人免疫球蛋白（human immunoglobulin for intravenous injection, IVIG）研究与应用最为广泛，临床上主要用于原发性免疫球蛋白缺乏症继发性免疫球蛋白缺乏症和自身免疫病的治疗[2]。研究人员对比低温乙醇蛋白分离工艺和离子交换层析工艺在IVIG制备过程中的杂质去除效果，结果如表2所示，与低温乙醇工艺相比, 层析工艺可以明显降低IVIG中的IgA和HSA含量[9]。李冠军[10]和张学成[11]也通过试验证明采用层析技术可以大幅度降低IVIG制品中IgA和IgM含量。

表2 两种不同工艺制备的IVIG成品质量指标结果

工艺	纯度(%)	分子大小分布(%)	PKA(IU/mL)	HAS(ng/mL)	IgA(ug/mL)
层析法	100	99.9	＜5	220	4.31
低温乙醇法	100	99.6	＜5	880	481

2.3. 人凝血因子类

2.3.1 人凝血因子Ⅷ

人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ，FⅧ）是人血液中的一种重要的凝血因子，是治疗甲型血友病的特效药。沉淀法是传统的FⅧ制备方法，虽然具有简单、快速、经济等优点，但是仅采用沉淀法获得的FⅧ纯度较低，并且含有大量杂蛋白，在临床使用中不良反应大等缺点，难以满足市场和临床需求。研究人员在沉淀法的基础上引入离子交换层析技术从血浆冷沉淀溶解液中提纯FⅧ，结果如表3所示，表明层析法不仅能获得较高纯度的FⅧ,而且能有效去除S/D灭活剂中的化学物残留量[12]。此外，我国许多学者也对层析法制备FⅧ进行了研究，如康丽梅[13]和张猛[14]等设计的FⅧ制备工艺均获得了较高的回收率和产品比活性。

表3两种工艺制备的FⅧ成品检定结果

工艺	比活性(IU/mg)	Tween-80残留量(µg/ml)	TNBP残留量(µg/ml)	PEG残留量(g/L)
标准	≥10	≤100	≤10	≤0.5
沉淀法	3.8	42	4	0.02
层析法	61.8	43	0.8	0.02

2.3.2 人纤维蛋白原

人纤维蛋白原（human fibrinogen, Fg）主要由肝脏细胞合成和分泌，是机体止血生理中重要的凝血因子，也是凝血系统中的“中心”蛋白质之一。临床上Fg主要用于治疗先天性、获得性纤维蛋白原减少或缺乏症及其它情况引起的凝血障碍。传统制备工艺沉淀法获得的Fg溶解性、凝固活力和纯度低且复溶时间长。目前Fg市场仍处于短缺状况，开发出新的高纯度和高溶解性的Fg提取工艺显得尤为必要。因此研究人员以血浆冷沉淀为原料，利用离子交换层析技术制备Fg，结果如表4所示，表明引入离子交换层析技术不仅可以有效解决Fg纯度问题，而且制品安全性、稳定性好[15,16]。

表4 Fg层析法成品检定结果

研究人员	纯度(%)	凝固活力(s)	TNBP残留量(μg/mL)	Tween-80残留(μg/mL)
标准	≥70	≤60	≤10	≤100
李斌	98	12	1	31
雷文成	87.4	27	6.4	23

2.3.3 人凝血酶原复合物

人凝血酶原复合物（prothrombin complex concentrate, PCC）是一种含有凝血因子II、VII、IX和X的血液制品，也称因子IX复合物。主要用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症。传统的无机盐吸附法虽然制备的PCC能满足临床要求，但是无法实现血浆的综合利用。1973年Heystek[17]首次提出了离子交换批式吸附法，用DEAE Sephadex A50凝胶介质从原料血浆中吸附四种凝血因子。我国学者余蓉等[18]从新鲜冷冻血浆中制备的PCC，其回收率可达90%左右，比活性可达16.28IU/mg。虽然该技术使用范围广，在PCC的生产制备过程中仍占据着主导地位，但存在较多的不足。如必须在搅拌罐内进行吸附，需要将凝胶转移至层析柱中进行洗涤和洗脱，凝胶易破碎，操作繁琐，周期较长且容易造成交叉污染等。

2.4. 其它微量蛋白

目前临床上以离子交换层析技术制备的微量蛋白有抗凝血酶、α1-抗胰蛋白酶和α2-巨球蛋白等。Miller-Andersson等[19]采用DEAE 离子交换层析结合亲和层析和凝胶过滤技术成功地从人血浆中分离出抗凝血酶Ⅲ。周雁翔等[20]引入DEAE Sepharose Fast Flow阴离子层析对乙醇冷沉淀FIV中α1-抗胰蛋白酶进行分离，其产品最终纯度达97.3%。郑德先等[21]采用Sephadex G-150层析介质成功分离出α2-巨球蛋白。

3 结语

随着医疗保障体系的不断完善和社会对疾病治疗意识的提高，临床中的非保守性手术治疗方式越来越普遍，从而推动了血液制品市场的发展。我国的血液制品行业是一个潜力很大的市场，而且发展很快。随着市场需求的多元化发展，原采用低温乙醇法生产的血液制品在品种及质量上均已不能满足社会的需要。应用层析技术能显著提高血浆利用率及产品质量，并丰富产品的种类和节约经济成本。在分析国内外现有层析技术的应用现状的基础上，并对其主流层析工艺进行了简要综述，为我国改进现有血液制品的工艺提供参考依据。

参考文献

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作者简介:李勇(1995-),男,汉族,云南曲靖,本科,助理工程师,研究方向:血液制品分离纯化

通讯作者:孙振宇(1971-),男,汉族,江苏盐城,本科,工程师,研究方向:血液制品技术。E-mail：[e-mail]