磷酸苯丙哌林胶囊微生物限度检查方法适用性试验

汪惠

摘要: 目的:为研究磷酸苯丙哌林胶囊的微生物限度检查方法。方法: 按照《中国药典》二零二零年版第四部的规定,通过平皿法、稀释法、膜过滤法三种检验方法,对所有测试菌株的回收率进行了测定。结果:使用膜过滤法测定细菌数量、霉菌和酵母菌总数，每一种菌株的回收率都在50%-200%之间。结论: 采用膜过滤法，可以有效地去除磷酸苯丙哌林胶囊的抑菌效果，能客观地反映出药物中的微生物污染情况，从而实现检测的目的，确保试验结果的准确性。

关键字：磷酸苯丙哌林胶囊微生物；膜过滤法；回收率

1材料

1.1仪器

电子天平、生化培养箱、高压蒸汽灭菌器、恒温振荡水浴摇床、微生物限度仪。

1.2样品

磷酸苯丙哌林胶囊

1.3培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄

糖液体培基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.4试验菌株

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲

霉，以上菌种均购自中国食品药品检定研究所的医学菌种保存管理中心，且所用菌种均为第三代。

1.5稀释液及冲洗液

实验用菌株稀释液为0.9% 无菌氯化钠溶液及0.9% 无菌氯化钠溶液（含0.05%的聚山梨酯80）；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，作为试验稀释剂，并作为膜过滤冲洗溶液。

   2方法

2.1 菌种

金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉。

2.2 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，于35℃下培养18~24小时,用0.9%的无菌氯化钠溶液进行稀释,制备细菌悬浮液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基，于25℃下培养2~3天，用0.9%的无菌氯化钠溶液进行稀释，制备悬浮液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基，置于25℃下培养7天，用0.9% 无菌氯化钠溶液（含0.05%的聚山梨酯80）进行孢子洗脱。将洗脱下来的孢子悬浮物用0.9% 无菌氯化钠溶液（含0.05%的聚山梨酯80）进行稀释，制备成一定浓度的悬浮液。

2.3试验方法

2.3.1试验组

平皿法：称取5g的试样, 加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml中，配制浓度比为1:10的供试溶液，于45℃的热水浴中摇动并充分溶解。将1:10供试液平均分成5份，往每份中分别加入0.1ml浓度合适的2.2项中制备的菌悬浮液（菌悬浮液与供试溶液的体积比为1:100），使得每1ml测试溶液的菌含量不超过100fu，充分混合，备用。将含细菌的菌悬液各取1ml加入一个平皿中，平行制备两个平皿，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基，培养5天；将含酵母菌和霉菌的菌悬液各取1ml加入一个平皿中，平行制备两个平皿，倒入沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养7天。

稀释方法：称取5g的试样,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml中，配成浓度比为1:10的供试物液,于45℃的热水浴中摇动并充分溶解。取1:10的供试液5ml, 加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml中，配成浓度比为1:100试验溶液。将1:100供试液平均分成5份，往每份中分别加入0.1ml浓度合适的2.2项中制备的菌悬浮液（菌悬浮液与供试溶液的体积比为1:100），使得每1ml测试溶液的菌含量不超过100fu，充分混合，备用。将含细菌的菌悬液各取1ml加入一个平皿中，平行制备两个平皿，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基，培养5天；将含酵母菌和霉菌的菌悬液各取1ml加入一个平皿中，平行制备两个平皿，倒入沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养7天。

膜过滤法：按平皿法制备1:10试验溶液，备用。取100mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，加入1ml含细菌供试液混合至滤杯中，过滤，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗300ml(每次100ml，冲三次),将过滤后的滤膜菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，每种菌株平行制备两个平板。用同样的方法进行过滤，将含酵母菌和霉菌的滤膜菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，每种菌株平行制备两个平板。

2.3.2菌液对照组

用50 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白缓冲液代替供试液，平均分成5份，每份分别加入0.1 mL合适浓度的2.2项中制备的菌悬浮液（菌悬浮液与供试溶液的体积比为1:100），使其菌含量不超过100 cfu，混合均匀，按照实验组的操作进行试验。

 2.3.3供试液对照组

称取5g的试样,加入无菌氯化钠缓冲液50ml中，配成浓度比为1:10的供试物液,于45℃的热水浴中摇动并充分溶解。以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌悬液，其余试验操作均同实验组，并与实验组结果进行对比。

3结果

3.1微生物计数试验结果

微生物回收率的计算公式是：各菌株的回收率=（试验组的菌数-供试液对照组的菌数）/菌液对照组的菌数×100%。

3.2 测试结果显示，该产品对五种菌株的生长均有一定的抑制效果。采用膜过滤法，能有效地去除对五种菌株的抑制作用，其各菌株的回收率达到50%~200%，见表 1、表2。

表1. 样品细菌回收试验结果

实验方法	细菌回收率/%
	金黄色葡萄球菌	铜绿假单胞菌	枯草芽孢杆菌
平皿法	0	0	0
	0	0	0
	0	0	0
稀释法	0	16	25
	0	18	23
	0	19	26
薄膜过滤法	82	83	89
	85	85	88
	84	86	88

表2. 样品霉菌和酵母菌回收试验结果

实验方法	霉菌和酵母菌回收率/%
	白色念珠菌	黑曲霉
平皿法	0	32
	0	30
	0	33
稀释法	25	92
	24	89
	27	90
薄膜过滤法	85	97
	87	95
	88	96

结语

在生产相同品种的情况下，如果生产过程发生变化，应重复该方法的适应性试验；由于原料药的产地、批次、辅料、生产工艺和其他方面的差异，不同公司生产的相同品种的产品应通过该方法的适应性测试来确定其可行性。本文所提出的检测方法对不同厂家的产品进行微生物限度检测具有一定的参考价值。

参考文献

[1]刘广文，苑艳飞．养肝解毒丸微生物限度检查法的验证实验［J］．中国医药科学，2016，6(13):54-57．

[2]陈志禹，席时东．中国药典 2015 年版八珍胶囊和八珍片微生物限度检查与探讨［J］．中国现代应用药学，2016，33(5):628-634．

[3]郑小玲，王征南，李珏．瑞他莫林软膏的微生物限度检查适用性试验［J］． 中国现代应用药学，2016，33(5):634-637．

［4］苏静芬．赛霉安乳膏微生物限度检查方法适用性检查［J］．海峡 药学，2016，28( 8): 81-83