Treg细胞及相关细胞因子在甲状腺相关眼病患者中水平的变化

李丹丹,汪敏,王丹,潘萍,翟玉霜,陈明霞

摘要：目的　通过检测甲状腺相关眼病患者外周血Treg数量在CD4+T 细胞中的百分占比，以及转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）水平，探讨Treg 细胞及TGF-β1在甲状腺相关眼病患者体内水平的变化及作用机制。方法　收集 2017年1月-2020年5月在我院内分泌科就诊并诊断为甲状腺相关眼病的患者外周血标本，参考美国甲状腺协会（ATA）发布的关于Graves眼病的分级标准（NOSPECS分级）：≧1级的患者入TAO组；同时按照欧洲Graves眼病专家组（EUGOGO）指南将TAO患者分为三组：轻度组（n=37）、中重度组（n=25）、危及视力组（n=12）；按照临床活动度评分（CAS）进行TAO炎症活动度的分级。GD组选择不合并眼征的Graves病患者（n=40）；对照组（C组）选择相匹配的我院健康体检者40例。采用流式细胞仪检测外周血中Treg细胞数量占CD4+T 细胞的百分比，使用双抗体夹心酶免疫吸附法(ELISA)检测血清TGF-β1水平，并进行相关性分析。结果（1）TAO组、GD组Treg细胞在CD4+T 细胞中的百分占比较C组下降，差异有统计学意义（P<0.05），且与GD组比较，TAO组下降更明显（P<0.05）。TAO组中，危及视力组和中重度组下降较轻度组更明显（P<0.05），但危及视力组和中重度组差异无统计学意义（2）TAO组TGF-β1水平高于GD组和C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；GD组TGF-β1水平高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。甲状腺相关眼病患者中，危及视力组和中重度组TGF-β1均高于轻度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；（3）甲状腺相关眼病患者CAS评分与Treg数量占CD4+T淋巴细胞百分比呈负相关（r=-0.734，P＜0.05），而与TGF-β1水平正相关（r=0.501；P＜0.05）。结论：甲状腺相关眼病患者外周血中Treg细胞百分比显著降低，而TGF-β1水平升高，且与甲状腺相关眼病患者CAS评分有相关性。

【关键词】 甲状腺相关眼病；Treg细胞；转化生长因子-β1

甲状腺相关眼病（Thyroid associated ophthalmopathy，TAO）是器官特异性自身免疫性疾病之一，属于Graves病中发生率最高的甲状腺外器官病变，亦称之为Graves眼病（Graves ophthalmopathy，GO）。在人群中的发病率约为42/100万，在GD患者中的发病率约为25%，可在任何年龄段发病，尤其好发于40-60岁女性。是发病率最高的成人眼眶疾病[1]。TAO的病理特点是眼球后结缔组织增生，主要累及眼眶脂肪和眼外肌。临床症状相对复杂多样，处于活动期的患者存在较为显著炎性反应，且眼部有异常物质沉积，眼睑以及结膜充血水肿。非活动期患者则表现为炎性活动减退，眶内组织纤维化以及脂肪化，眼球运动异常以及复视等[2]，严重影响患者的面部容貌，并有约5%的患者出现视力受损，甚至导致患者失明。近年来，随着认识的深入，人们发现TAO的发病机制可能与免疫、环境以及遗传等有关，其中免疫系统功能紊乱与甲状腺相关眼病的发生密切相关[2]，且呈明显的异质性。Treg细胞是CD4+T淋巴细胞的一个新亚群，能够抑制免疫反应[3，4]，维持免疫耐受[5，6]。研究表明，Treg细胞功能缺陷或细胞数量的变化参与了多种自身免疫性疾病的发生发展，但是否影响了甲状腺相关眼病的发病过程，目前国内外鲜有报道。本实验检测Treg细胞及相关细胞因子在甲状腺相关眼病患者外周血中水平的变化，探索Treg细胞对甲状腺相关眼病的影响。

1对象与方法

1.1 对象

收集2017年1月—2020年5月在河南大学淮河医院内分泌科诊断为甲状腺相关眼病的患者外周血标本74例。全部患者均详细询问病史，完善视野、眼球突出度等眼科常规检查、影像学检查（眼眶MRI）、甲状腺功能及甲状腺相关抗体水平测定等检查明确TAO诊断。根据美国甲状腺协会（ATA）Graves眼病分级标准（NOSPECS分级）：0级（N），无症状体征；1级（O），仅有体征；2级（S），软组织受累；3级（P），眼球前突；4级（E），眼外肌受累；5级（C），角膜受累；6级（S），视力丧失。符合Graves病诊断标准，排除其他原因引起的眼病，且分级≧1级的患者纳入TAO组。

参考欧洲Graves眼病专家组（EUGOGO）指南，按照眼病的严重程度对TAO患者进行分组。轻度组：病情较轻，仅影响日常生活，不需手术干预或免疫抑制治疗；轻度软组织受累，眼睑回退＜2mm，突眼超过参考值＜3mm，一过性或无复视，无角膜暴露；中重度组：病情虽尚未危及视力，但需手术干预或免疫抑制治疗；软组织中重度受累，眼睑回退＞2mm，突眼超过参考值＞3mm，间歇性或持续性复视；危及视力组：甲状腺相关视神经损害或角膜溃疡，危及视力。按照临床活动度评分（CAS）进行TAO炎症活动度的分级。共纳入74例，其中轻度组37例（平均年龄37.46±11.13岁），中重度组25例（平均年龄48.09±9.70岁），危及视力组12例（平均年龄50.12±12.00岁）。排除炎性假瘤、甲状腺结节、甲状腺癌及其他自身免疫病等。

GD组：符合«内科学»（第九版）关于Graves病的诊断标准且不合并眼征，共40例。

正常对照组：40例，于河南大学淮河医院体检中心体检的健康人群，无甲状腺疾病病史，无家族自身免疫性疾病史，甲状腺功能及相关抗体均正常，无眼部症状。

经河南大学淮河医院伦理委员会批准同意使用研究对象的临床资料和收集血样标本。采血前告知所有研究对象采血目的，签署知情同意书后采集新鲜外周静脉血。

1.2 方法

1.2.1 主要设备及试剂

Foxp3-PE抗体、CD25-PE-CY5抗体、CD4-FITC抗体、同型对照（lgG-PE）抗体（Becton Dickinso公司）。淋巴细胞分离液、固定剂、破膜剂（Sigma公司）。TGF-β1 ELISA试验试剂盒（晶美生物），流式细胞仪EPICS.XL型（Backman Coulter公司）。

1.2.2 标本采集

上午空腹用无菌肝素抗凝管收集研究对象静脉血3 ml，置于4 ℃冰箱，当天处理。

1.2.3 流式细胞计数外周血中Treg 细胞比例

应用Percoll 密度梯度法离心分离外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用PBS调整细胞浓度为1×107/ml，4 ℃备用；取4个试管分别加入100μL PBMC细胞悬液，其中3管分别加入相应的同型对照抗体作为阴性对照，检测管先加入CD4-FITC和CD25-PE-CY5抗体避光孵育，再按说明书分别加入固定／破膜剂破膜后，加入Foxp3-PE抗体进行细胞内分子标记。用流式细胞仪检测并应用Flowjo 7.6软件计算Treg 细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。实验重复3 次，取平均值。

1.2.4 三组血清TGF-β1检测 抽取空腹外周血3 mL，采用ELISA 法检测血清TGF-β1水平。所有操作均严格按照使用说明书进行。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，各项指标组间比较采用t 检验；Pearson相关性分析两变量间线形关系，非正态数据则采用Spearman相关分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞计数

TAO组（1.02±0.13）、GD组（1.66±0.15）Treg细胞在CD4+T淋巴细胞中的比例较C组（2.92±0.24）下降，差异有统计学意义（P<0.05），且与GD组比较，TAO组下降更明显（P<0.05）。TAO组中，危及视力组和中重度组下降较轻度组更明显（P<0.05），但危及视力组和中重度组差异无统计学意义（表1）。

表1 各组外周血中Treg细胞的比例(%, x±s)

Group(n)	Treg(%)
TAO(n=74）	1.02±0.13＊
轻度组（n=37）	1.07±0.16
中重度组（n=25）	0.91±0.23＃
危及视力组（n=12）	0.85±0.15＃
GD(n=40）	1.66±0.15＊
C(n=40）	2.92±0.24

＊和对照组比较， P<0.05； ＃ 和TAO轻度组比较 P<0.05.

2.2 各组TGF-β1水平的比较：TAO组TGF-β1水平高于GD组和C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；GD组TGF-β1水平高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。甲状腺相关眼病患者中，危及视力组和中重度组TGF-β1均高于轻度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；（表2）

表2 各组外周血中TGF-β1水平的比较（pg/ml，x±s）

Group(n)	TGF-β1
TAO(n=74）	0.97±0.21＊
轻度组（n=37）	0.87±0.16
中重度组（n=25）	1.22±0.13＃
危及视力组（n=12）	1.47±0.24＃
GD(n=40）	0.61±0.12＊
C(n=40）	0.33±0.19

＊和对照组比较， P<0.05； ＃ 和TAO轻度组比较 P<0.05.

2.3 甲状腺相关眼病临床活动度评分（Clinical Activity Score, CAS）与Treg及TGF-β1水平的相关性：甲状腺相关眼病患者CAS评分与Treg数量占CD4+T淋巴细胞百分比呈负相关（r=-0.734，P＜0.05），而与TGF-β1水平正相关（r=0.501；P＜0.05）。

3 讨论

目前研究发现，甲状腺相关眼病是一种细胞免疫和体液免疫共同参与的具有器官特异性的自身免疫性疾病。眼眶成纤维细胞（Orbital Fibroblasts，OF）激活是甲状腺相关眼病发生的关键[7]。甲状腺相关眼病患者OF表面可异常表达某些自身抗原，如促甲状腺素受体(Thyroid-Stimulating Hormone Receptor，TSHR)，这些自身抗原被抗原呈递细胞呈递给T细胞，诱导T细胞活化，启动自身免疫，结果导致OF成为免疫攻击的靶细胞。另外，OF在活化T细胞所释放的细胞因子刺激下，可发生增殖，分泌大量透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）和胶原蛋白等，造成球后组织水肿，同时加速其向脂肪细胞的转化，造成球后脂肪组织体积增大

[8]。以上机制成为导致甲状腺相关眼病患者眼球突出的主要原因。

T细胞是机体免疫系统中的主要效应细胞，它可以通过对抗原特异性的识别，维持机体生理状态的免疫功能[9]。近年来研究发现，CD4+CD25+Treg细胞是一群不同于Th1和Th2细胞，具有免疫抑制和免疫调节等特点的T细胞亚群［10］。免疫抑制是指其能够抑制 CD4+T、CD8+T 和自然杀伤细胞等免疫效应细胞的活化与增殖，同时能够抑制B细胞、树突状细胞和巨噬细胞的功能。Treg细胞能够识别自身抗原并抑制效应性T细胞的免疫反应，是自身免疫耐受不可缺失的一环，在防止自身免疫损伤和维持自身免疫稳定方面发挥重要作用[6,11]，目前已成为自身免疫病发病机制的研究热点。我们的研究结果也显示，甲状腺相关眼病患者外周血Treg数量占CD4+T淋巴细胞百分比降低，危及视力组和中重度组下降较轻度组更明显，且与甲状腺相关眼病患者CAS评分成负相关，这与Treg细胞的免疫抑制作用降低有一定关系。Treg细胞存在低反应性以及免疫抑制性等特点，可通过促进有关细胞因子的合成、分泌，从而对效应T细胞活化状态起到调控作用，促进细胞增殖周期的延长，进而使得活化免疫细胞的清除，最终发挥负向调控效应T细胞以及抗原提呈细胞的作用。提示Treg细胞表达异常导致机体免疫功能紊乱可能是甲状腺相关眼病发生发展的原因之一,当Treg细胞含量减少，机体免疫平衡被打破，从而促进自身免疫性疾病的发生、进展。

TGF-β1属于TGF-β超家族成员［11］，多种组织细胞可以合成，以自分泌或旁分泌的方式，调节细胞的生长和分化，广泛参与各种生理活动。在机体免疫系统中，TGF-β1还是一个重要的免疫调节因子，参与维持自身免疫耐受和T细胞稳态［12］。近年来研究发现，TGF-β1作为一种多功能的细胞因子，不仅参与调节多种生理过程，而且还参与多种病理过程，在生理状态下，TGF-β1含量较少，但在某些病理情况下，如肿瘤及炎症等疾病中，TGF-β1含量会显著增加，说明TGF-β1表达水平异常与某些疾病的发生发展密切相关［11,13］。本研究应用 ELISA方法检测甲状腺相关眼病患者血清中TGF-β1的表达水平。结果发现，甲状腺相关眼病患者TGF-β1水平较GD组和C组升高，其中危及视力组和中重度组TGF-β1升高更明显，且与甲状腺相关眼病患者CAS评分正相关，进一步提示TGF-β1可能参与了甲状腺眼病发生发展的过程。

甲状腺相关眼病是一种由多基因遗传、环境因素及免疫因素相互作用的自身免疫性疾病。一定遗传背景下，CD4+CD25+Treg 淋巴细胞与效应性T淋巴细胞的免疫失衡，导致自身反应性T淋巴细胞的活化是甲状腺相关眼病免疫学发病机制的中心环节［14，15，16］。我们的研究结果显示甲状腺相关眼病患者外周血中Treg淋巴细胞数量显著低于正常人，而TGF-β1水平升高，且与甲状腺相关眼病患者CAS评分成一定的相关。表明Treg 淋巴细胞与相关细胞因子可能与眼眶成纤维细胞的激活和增殖有一定的相关性，参与了甲状腺相关眼病的发生和发展。

综上所述，Treg 淋巴细胞水平的变化与甲状腺相关眼病的发生发展有一定的相关性。相关细胞因子同细胞内的各种蛋白和信号通路共同调节着眼眶成纤维细胞的增殖、分化及凋亡。他们之间的相互作用，参与了甲状腺相关眼病的发生发展。

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河南省科技攻关项目（212102310789）
第一作者简介：李丹丹(1982.04-)，女，河南孟津人，主任医师，硕士学位，研究方向为内分泌及代谢性疾病，e-mail：[e-mail]