芹黄素的抗UUO大鼠肾脏纤维化作用及机制研究

王湛

【摘要】目的：探讨芹黄素的抗UUO大鼠肾脏纤维化作用及机制。方法：以SD大鼠45只为研究对象，随机分为假手术组、模型组、依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组4组大鼠均于术前3d开始分别给予生理盐水、1mg依那普利、20mg/kg芹黄素、40mg/kg芹黄素, 术后连续给药2周。观察各组肾组织形态学、肾皮质中Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达差异。结果：UUO组大鼠肾脏Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白蛋白表达最高，依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组的肾脏大鼠肾脏、Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达水平依次下降(P＜0.01)。结论；芹黄素具有抗UUO大鼠肾纤维化的作用，可能是通过通过抑制EMT的形成和ECM的沉积来实现。

【关键词】芹黄素；肾脏纤维化；UUO大鼠；

目前，临床上对肾脏纤维化主要采用血管紧张素受体拮抗剂(ARB)和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)等药物治疗，并能获得一定的疗效，但并无法阻断肾纤维化的进展，且常伴随着多种不良反应 [1]。故找到一种有效阻止肾纤维化进展的物质是当前抗肾纤维化治疗的热点。

芹黄素又名芹菜素，是一种广泛存在于多种植物中的黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化的作用，在医药、保健等方面的应用前景广阔。但近年来有实验证实，芹黄素具有抗纤维化的作用，但其机制尚不明确[2]。本研究建立单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾脏纤维化模型，探讨芹黄素干预对肾脏纤维化的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物  

健康成年雄性SD大鼠45只，体质量(200±10)g，8～12周龄，购自河南康达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(豫)2020-031。标准条件饲养，自由获取食物和水，室温维持22℃左右，相对湿度为30%～ 70%。

1.2试剂、药物和仪器

芹黄素对照品,血管紧张素, α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、纤维连接蛋白(Fib)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)和Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)抗体(美国CMCTAG公司), HRP标记山羊抗鼠二抗 (上海碧云天生物技术有限公司)。超净工作台(江苏苏净集团有限公司)；倒置显微镜(重庆澳浦光电技术有限公司);低速离心机(北京雷博尔离心机有限公司)。

1.3方法

1.3.1 UUO模型建立和分组

随机将45只大鼠分为假手术组、模型组、依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组。模型组、依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组大鼠均用1%戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉SD大鼠，于左腹部行一小切口，剥离左侧输尿管，于近端中上1/3处双结扎输尿管，从两个结扎处间剪断输尿管并逐层缝合腹腔；4组大鼠均于术前3d开始分别给予生理盐水、1mg依那普利、20mg/kg芹黄素、40mg/kg芹黄素, 术后连续给药2周。假手术组只分离输尿管，不接扎、不剪断。

1.3.2 标本采集

术后2周，处死大鼠，取出肾脏，除去肾包膜，用4℃生理盐水冲洗，从中间纵向切开二等分，一份制备用于蛋白匀浆,一份用4%多聚甲醛缓冲液固定。

1.3.2肾组织形态学观察

取出用4%多聚甲醛缓冲液固定的肾组织标本，常规脱水、石蜡包埋，切片，脱蜡至水，以5%硫代硫酸钠浸泡5min，加入Weigert氏铁苏木素染色液反应5～10min，盐酸乙醇溶液分化，丽春红酸性品红液染色，冰醋酸溶液处理，无水酒精脱水多次，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察肾小管扩张管型形成和间质细胞外基质沉积，并用图像分析软件对肾脏纤维化程度进行量分析。

1.3.3 肾皮质中Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达

取动物肾脏组织标本，按20mg组织∶ 200 L 裂解液的比例加入预冷裂解液，充分裂解后取上清，用BCA蛋白法进行蛋白定量，行SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PBS冲洗3次，加入抗体(1∶2000)，4℃摇床孵育12h，加HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶500)，室温摇床孵育1h，采用化学发光ECL显影。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据统计学分析，实验结果用(x±s)表示，多组见比较采用协方差分析，两两比较用SNK q检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芹黄素对UUO大鼠胶原纤维沉积的影响

Masson染色结果显示，与假手术组比较，UUO组、依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组大鼠肾脏均有不同程度的胶原纤维沉积，其中UUO组胶原纤维沉积量最多，依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组的肾脏胶原纤维沉积量依次减少(P＜0.01)。

2.2 芹黄素对UUO大鼠肾脏皮质中Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达

BCA蛋白法蛋白定量分析显示，免疫组化结果显示，与假手术组比较，UUO组、依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组大鼠肾脏皮质中Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达均有不同程度的升高，其中UUO组大鼠肾脏皮质中Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达最高，依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组的肾脏大鼠肾脏皮质Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达水平依次下降(P＜0.01)。

表3 各组大鼠肾脏皮质中Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达(x±s)

组别	数量	Col I	Col Ⅲ	Fib
假手术组	15	1.02±0.05	1.03±0.07	1.01±0.04
UUO组	15	2.36±0.14	2.48±0.18	2.44±0.16
依那普利组	15	2.26±0.12	2.31±0.15	2.34±0.13
20mg/kg芹黄素组	15	2.01±0.11	2.14±0.12	2.09±0.10
40mg/kg芹黄素组	15	1.43±0.07	1.67±0.09	1.55±0.08
F		7.084	7.628	6.947
P		0.000	0.000	0.000

3 讨论

肾脏纤维化表现为肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达上调，从而导致肾小管上皮细胞和系膜细胞等转化为肌成纤维细胞，进而造成大量ECM积聚，最终造成肾小球硬化、肾小管间质纤维化而使肾功能出现严重损害[3]。

肾脏纤维化是CKD的主要病理基础，本研究通过构造经典UUO大鼠模型来探讨芹黄素在UUO大鼠肾脏纤维化中的作用和机制，结果显示，UUO组大鼠肾脏Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白表达最高，依那普利组、20mg/kg芹黄素组、40mg/kg芹黄素组的肾脏大鼠肾脏Col I、Col Ⅲ、Fib蛋白蛋白表达水平依次下降(P＜0.01)，说明芹黄素的抗肾纤维化的机制可能是通过抑制EMT的形成和ECM的沉积来实现。

综上所述，芹黄素具有抗UUO大鼠肾纤维化的作用，可能是通过通过抑制EMT的形成和ECM的沉积来实现。

                        参考文献

[1]张鹏,乔晞,乔海燕,等.阿魏酸钠联合缬沙坦对糖尿病肾病患者的疗效及对肾脏纤维化的影响[J].现代生物医学进展,2020,20(11):2148-2151+2163.

[2]慢性肾脏病治疗的新靶点——连接蛋白43[J]. 汪琪,李玉斌.  海南医学. 2019(08)

[3]沙棘化学成分及药理作用的研究进展[J]. 周浩楠,胡娜,董琦,王洪伦.  华西药学杂志. 2020(02)

基金项目：河南省高等学校重点科研项目计划（21A310007）

基金项目：河南省高等学校重点科研项目计划（21A310007）

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