两种致敏源对哮喘疾病模型猴炎症细胞影响的比较

叶箭梦,李岳锋,李广业,胡文影,邓志峰,邱春梅

【摘要】目的：探讨卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）和猪蛔虫蛋白（Pig Ascaris Protein，PAP）这两种常见哮喘致敏源在致敏前后对支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞计数影响的异同，并在激发前、激发后、激发后1h分别采样，比较给药后不同时间各炎症细胞的变化情况，为食蟹猴哮喘模型研究中采样的最佳时间提供参考。方法：食蟹猴随机分组，其中OVA组5只，PAP组3只。采用第一周腹腔注射，第二周腹腔注射，第四周皮下给药，第五周雾化给药，第七周肌肉注射，第十周雾化给药，第十四周强化雾化给药的方式致敏。给药频率为每周1次。腹腔注射、皮下注射、肌肉注射的OVA浓度为1mg/ml，PAP浓度为3.33mg/ml，给药量均为1ml/kg。雾化给药OVA浓度为12mg/ml，PAP为4mg/ml，以口罩的形式，让猴子吸收约40个呼吸。致敏给药完成后，将猴子转移至激发笼内，通入相应的雾化致敏溶液2min进行激发。分别在给药前、激发前、激发后1h采用气道插管的形式采集BALF。用瑞士-吉姆萨染色法，油镜下分类计数淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的比例。另取BALF裂解红细胞后冲池，计数除上皮细胞外的所有细胞总数。结果：与给药前相比，两组BALF细胞总数均没有显著变化。与给药前相比，OVA组中性粒细胞在激发后1h显著升高（P<0.05），淋巴细胞没有显著变化，嗜酸性粒细胞在激发后、激发后1h均显著升高（P<0.05）。与给药前相比，PAP组中性粒细胞在激发前、激发后、激发后1h均有显著升高（P<0.05，其中激发前P<0.01），淋巴细胞在激发后有显著升高（P<0.05），嗜酸性粒细胞在激发前、激发后、激发后1h均有升高，但无统计学意义。结论：OVA致敏后BALF中性粒细胞和嗜酸性粒细胞增多，其特征与嗜酸性粒细胞性哮喘接近，采样最佳时间出现在激发后1h；PAP致敏后BALF中性粒细胞和淋巴细胞增多，其特征与非嗜酸性粒细胞性哮喘接近，采样最佳时间出现在激发后。这为哮喘动物模型的制作提供参考价值。

【关键词】卵白蛋白；猪蛔虫蛋白；哮喘；支气管肺泡灌洗液；炎症细胞计数

支气管哮喘（简称哮喘）是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病[1]，具有可逆性气道阻塞，黏液分泌增加，气道炎症，气道高反应性和气道重塑的特征。有数据表明全球哮喘患者大约有 3 亿人，中国患者约有3000万人，并呈逐年上升趋势[2]。因此，建立理想的哮喘动物模型在研究其病因、发病机制以及新药开发中有着重要意义。非人灵长类动物的免疫学特征与人高度相似[3]，在哮喘动物模型研究中具有独特优势。

文献报道有多种抗原可用于诱导哮喘动物模型。常用的是卵白蛋白、猪蛔虫蛋白、血小板激活因子、花粉、内毒素、结晶细菌性α-淀粉酶等。卵白蛋白（ovalbumin，OVA）来源于蛋清，不会在人体内引起气道炎症，价格便宜，有很强的免疫原性[4]，因此被认为是一种良好的过敏原。我国儿童哮喘病例中大部分为外源性哮喘（过敏性哮喘），在众多的变应原(过敏原)之中，蛔虫是一种较为重要的变应原[5]。国内外关于猪蛔虫蛋白（Pig Ascaris Protein，PAP）致喘动物模型也常有报道[6-7]。

人类哮喘急性发作会伴随气道炎症细胞增多，支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎症细胞增多已成为哮喘动物模型建立成功的评价指标[8]。

本实验分别使用OVA和PAP致敏食蟹猴，探讨两种致敏源在致敏前后对BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞计数影响的异同，并在激发前、激发后、激发后1h分别采样，比较给药后不同时间各炎症细胞的变化情况，为食蟹猴哮喘模型研究中采样的最佳时间提供参考。

1材料与方法

1.1 实验材料及仪器

普通级食蟹猴8只，其中OVA组5只，PAP组3只，均为雄性，年龄2-5岁，体重2-5kg，来源并饲养于广东蓝岛生物技术有限公司。OVA、氢氧化铝购自美国 Sigma-Aidrich 公司，PAP购自上海起发实验试剂有限公司，2,4-二硝基苯酚（2,4-Dinitrophenol，2,4-DNP）购自阿拉丁试剂公司，瑞氏-吉姆萨快速染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，雾化器购自江苏鱼跃医疗。激发笼是自制的笼具，0.8m（长）×0.8m（宽）×0.9m（高），四面用PVC板材密闭，顶部有开口用于空气流通和通雾化气体。

1.2 实验方法

1.2.1药物配制

称量1.2533g氢氧化铝固体和0.1g OVA粉末在研钵中混匀，边研磨边加入100ml 0.9%生理盐水，研磨至混匀至溶液颜色均一，得1mg/ml OVA溶液，用于腹腔、皮下、肌肉注射给药。称量0.3g OVA粉末，加入25ml 0.9%氯化钠溶液，混匀至溶液澄清，用于雾化给药。

称量0.01g 2，4-DNP与0.1g猪蛔虫蛋白混匀，加入30ml 0.9%氯化钠溶液，混匀至溶液澄清，用于腹腔、皮下、肌肉注射给药。称量0.01g 2，4-DNP与0.1g猪蛔虫蛋白混匀，加入25ml0.9%氯化钠溶液，混匀至溶液澄清，用于雾化给药。

1.2.2 给药方式

采用第一周腹腔注射，第二周腹腔注射，第四周皮下给药，第五周雾化给药，第七周肌肉注射，第十周雾化给药，第十四周强化雾化给药的方式致敏。给药频率为每周1次。腹腔注射、皮下注射、肌肉注射的给药量为1ml/kg，其中皮下注射为多点注射。雾化给药方式：50mg/ml氯胺酮以0.1ml/kg的量肌肉注射液麻醉猴子，麻醉后雾化器雾化对应的药物溶液，以口罩的形式，让猴子吸收，每次吸收约40个呼吸。

1.2.3 激发方式

致敏给药完成后，将清醒状态下的猴子转移至激发笼内，向笼内通入相应的雾化致敏溶液2min，猴子出现喘息、呼吸困难、气促、咳嗽等过敏症状。以0.1ml/kg氯胺酮麻醉猴子，采用气道插管的形式采集BALF。1h后再次采集BALF。

1.2.4 BALF的采集及细胞分类计数

用氯胺酮麻醉猴子，分别在给药前、激发前、激发后1h采用气道插管的形式采集BALF。使用10ml的0.9%生理盐水灌洗，回收率50%以上。将BALF置冰上用两层纱布过滤，4℃800 ×g离心5 min，弃掉部分上清液以浓缩BALF。用瑞士吉姆萨染色液快速染色，油镜下分类计数200个细胞，算出淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的比例。另外取肺泡灌洗液裂解红细胞后冲池，计数除上皮细胞外的所有细胞总数。

1.3统计学处理

本实验数据采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，激发前、激发后、激发后1h三组分别用配对T检验与诱导前组进行组间比较，以P＜0. 05或P＜0. 01为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞总数结果

OVA组和PAP组BALF细胞总数在给药前后均没有明显差异（图1）。

图1  BALF细胞总数

2.2 中性粒细胞结果

OVA组：与给药前（6.8±1.3）相比，激发前和激发后有升高，但无统计学意义；激发后1h有显著升高（56.2±9.0，P=0.004）（图2）。

PAP组：与给药前（4.0±2.7）相比，激发前（23.33±1.45）、激发后（13.0±5.0）、激发后1h（61.0±23.1）均有明显升高，差异显著（P值分别为0.002、0.046、0.041）。

两组BALF中性粒细胞比例变化趋势一致，激发前较给药前增高，激发后稍微降低，1h后大幅升高。

*：与给药前相比，P<0.05；**：与给药前相比，P<0.01

图2  BALF中性粒细胞分类计数

2.3 淋巴细胞结果

OVA组：给药前和给药后的3次采样中BALF淋巴细胞比例均无明显变化（图3）。

PAP组：与给药前（7.67±0.67）相比，激发前（14.0±3.51）有升高，但无统计学意义；激发后有显著升高（18.33±2.85，P=0.04）；激发后1h（7.33±2.60）无明显变化。

两组的BALF淋巴细胞比例均在激发后升高，1h后下降。。

*：与给药前相比，P<0.05

图3  BALF淋巴粒细胞分类计数

2.4 嗜酸性粒细胞结果

OVA组：与给药前（0.4±0.3）相比，激发前（2.6±1.44）有升高，但无统计学意义；激发后（2.2±0.58）、激发后1h（2.4±0.51）均有明显升高，差异显著（P值分别为0.037、0.011）（图4）。

PAP组：与给药前（0.1±0.1）相比，激发前（1.0±0.58）、激发后（2.0±1.0）、激发后1h（1.67±0.88）均有升高，但无统计学意义。

PAP组的BALF嗜酸性粒细胞比例在激发后出现峰值，1h后降低。

*：与给药前相比，P<0.05

图4  BALF嗜酸性粒细胞分类计数

3讨论

哮喘的病因十分复杂，发病机制及治疗手段也未完全研究清楚，越来越深入的研究都需要建立哮喘模型。非人灵长类动物在遗传进化、生理、病理以及免疫学特征方面与人类高度相似，能很好地模拟人类多种疾病的发生发展过程，因此非人灵长类动物疾病模型越来越受到重视。

哮喘患者的气道均有不同程度的炎症改变，如炎症细胞浸润、早期肥大细胞活化,继而嗜酸细胞聚集，选择性的T淋巴细胞活化,炎症细胞释放炎症介质和细胞因子，引起一系列病理生理改变[9]。

气道的嗜酸性粒细胞浸润是哮喘的重要特征之一。嗜酸性粒细胞颗粒中含有嗜酸细胞阳离子蛋白(ECP)、主要碱基蛋白(MBP)、嗜酸细胞过氧化酶(EPO)和嗜酸细胞神经毒素(EDN)等。这些蛋白具有很强的细胞毒性作用，引起气道上皮损伤、剥脱和气道高反应性。

T淋巴细胞在哮喘气道慢性炎症的始动和维持中起调控作用。T淋巴细胞在哮喘中的作用集中表现在lgE合成的异常调节并通过细胞因子来实现。

既往认为哮喘是以嗜酸粒细胞炎症为特征的变应性疾病。随着研究的深入，越来越多的研究证实哮喘气道炎症表现为嗜酸性粒细胞性哮喘（eosinophilic asthma，EA）及非嗜酸性粒细胞哮喘（non-eosinophilic asthma，NEA）两种亚型，而大部分NEA表现为中性粒细胞气道炎症[10]。中性粒细胞可能通过释放LTB4、PAF、IL-8等参与炎症形成。

过敏性哮喘模型的造模剂常有卵白蛋白、猪蛔虫蛋白、花粉、有机粉尘等，其中卵白蛋白致敏研究最充分，模型最成熟。在儿童哮喘病例中，蛔虫是一种较为重要的变应原，由此国内外也有不少研究使用猪蛔虫蛋白制作哮喘动物模型。但国内外暂无研究比较两种致敏源所致哮喘动物模型的异同。

本实验用OVA和PAP两种致敏源诱导食蟹猴，经过十四周的给药周期后，对猴子进行激发，采集BALF做炎症细胞分类计数，比较给药前、激发前、激发后、激发后1h各炎症细胞的比例变化。

OVA组给药后中性粒细胞和嗜酸性粒细胞都有显著增多，与EA的临床特征接近；而PAP组给药后中性粒细胞和淋巴细胞显著增多，与NEA临床特征更接近。这为制作EA或NEA动物模型用何种致敏源提供参考价值。

OVA组中性粒细胞在激发后1h出现明显增多，嗜酸性粒细胞在激发后和激发后1h均出现明显的增多，这提示我们BALF采样的最佳时间出现在激发后1h。PAP组中性粒细胞在激发前、激发后、激发后1h均有明显升高，淋巴细胞只有激发后有明显升高，1h后大幅下降，这提示我们BALF采样的最佳时间出现在激发后。

综上所述，从本实验结果可以看到，OVA致敏后BALF炎症细胞变化特征与EA接近，采样最佳时间出现在激发后1h；PAP致敏后BALF炎症细胞变化特征与NEA接近，采样最佳时间出现在激发后。这为哮喘动物模型的制作提供参考价值。

参考文献

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[2] Giovannini-Chami L，Albertini M，Scheinmann P，et al. New in-sights into the treatment of severe asthma in children[J]. Paediatr RespirRev，2014，16（3）：167-173.

[3] 郑宏毅,郑永唐. 非人灵长类动物: 免疫学基础研究到临床应用的桥梁[J].中国免疫学杂志，2018,34（8）:1121.

[4] 刘传合，薛全福，陈育智. 支气管哮喘动物模型的研究状况［J］. 中华结核和呼吸杂志，2000，23（11）：647-649.

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[7] Hirshman C A,Malley A,Downes H. Basenji-Greyhound dog model of asthma: reactivity to Ascaris suum, citric acid, and methacholine［J］. Journal of applied physiology,1980:953-7.

[8] Huang ZG，Gao LJ，Zhao X，et al. Effect of Gubenfangxiao decoction on respiratory syncytial virus -induced asthma and expression of asthma susceptibility gene orosomucoid 1-like protein 3 in mice[J]. J Tradit Chin Med，2016，36（1）：101-106.

[9] 孔灵菲. 哮喘发病机理研究的新进展[J]. 临床内科杂志，1998，15（5）：225-226.

[10] Nakagome K,Matsushita S, Nagata M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int Arch Allergy Immunol,2012,158 Suppl 1:96-102.