白花丹参内生真菌的分离及体外抑制枯萎病菌活性研究

张思尚1＃，张潇煦1＃，钟晓旭1，王传兆1，王聪1，路欣荣2，李效良1*，李艳玲1

2山东弘宝农林开发有限公司，山东莱芜 271108

摘 要：对白花丹参植株不同部位进行内生真菌的分离纯化，并进行体外抑制病原真菌活性研究。共从白花丹参的根、茎、叶中共分离得到26株内生真菌，其中BHDSG-1对两种病原菌的抑制率为85.4%和75%，为白花丹参的生物防治及综合开发利用提供了理论依据。

关键词：内生真菌；病原真菌；分离；白花丹参；抑菌活性

白花丹参为唇形科植物丹参的变型，主产于山东莱芜地区，属濒危珍稀药用植物[1]，具有活血祛淤、通经止痛、凉血消痈、养血安神的功效[2]。

内生真菌在长期的共同进化过程中，与宿主植物之间逐渐建立起良好的共生关系[3]，增强了宿主植物的生长和竞争能力。因此，本研究从白花丹参中分离抗枯萎病病原菌的内生真菌，为丹参枯萎病防治奠定基础。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

供试植物材料:从山东弘宝农林开发有限公司药用植物园采摘的优质白花丹参植株。

病原真菌菌株:SZBG1、SZBG6为丹参枯萎病菌。

1.1.2 培养基

试验中所使用的培养基为PDA培养基。

1.2方法

1.2.1植物材料的表面消毒

从药用植物园中取得优质白花丹参植株，用流水冲洗干净后，对其进行表面消毒[3]处理：先使用5%次氯酸钠浸泡组织5min，然后用无菌水冲洗组织4遍；再使用75%乙醇溶液浸泡组织2min。

1.2.2 白花丹参内生真菌的分离纯化

将消毒好的根、茎、叶组织进行处理，根、茎去掉表皮组织修剪成边长为5mm的植株组织块，然后将上述组织块分别放入加有氨苄的PDA培养基中，28℃恒温培养7d，挑取形态不同的菌丝移种到新的PDA培养基上，并进行编号。

1.2.3抗枯萎病内生真菌菌株的筛选

采用平板对峙[4]的实验方法，初步筛选出具有抗真菌活性的白花丹参内生真菌菌株。按照公式，计算出白花丹参内生真菌对两种病原真菌SZBG1和SZBG6的抑制率。

抑制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－0.5）×100%

1.2.4 统计学方法

所有处理均重复3次，采用SPSS 18. 0软件对实验数据进行分析。

2.结果与分析

2.1白花丹参内生真菌多样性

从白花丹参根部、茎部、叶部共分离得到26种内生真菌,命名为BHDSG-1，…, BHDSG-15；BHDSJ-1,…, BHDSJ-8； BHDSY-1…, BHDSY-13。

2.2初筛具有抑制病原真菌作用的内生真菌

白花丹参内生真菌26个菌株与SZBG1和SZBG6两种病原真菌均接种到PDA培养基中，对峙培养7天，筛选出具有抑菌作用的17种菌株，并计算出所示的分离率（表1）。

表1 白花丹参内生真菌的分离率

组别	叶部	根部	茎部
菌种数量	13	5	8
有抑菌活性的菌种数量	9	3	5
分离率（%）	69.2	60	62.5

2.3复筛具有较强抑制病原真菌活性的内生真菌

将筛选出的17种内生真菌菌株与SZBG1和SZBG2接种到PDA培养基中，对峙培养7天，筛选具有较强抑制病原真菌活性的12种内生真菌菌株，分别为BHDSG-1，BHDSG-2，BHDSG-3；BHDSJ-1，BHDSJ-3， BHDSJ-6；BHDSY-1， BHDSY-3，BHDSY-6，BHDSY-7， BHDSY-11， BHDSY-13（图1）。

BHDSY-1 BHDSY-3 BHDSY-6

BHDSY-7 BHDSY-11 BHDSY-13

图1 白花丹参根茎叶中具抑菌作用的内生真菌

2.4丹参内生真菌对病原真菌的抑制效果

12株内生真菌菌株的抑菌率如表2所示，其中BHDSG-1对两种病原菌的抑制率为85.4%和75%，与对照相比，差异显著（P<0.01）。

表2 白花丹参内生真菌的抑菌率

抑菌菌种	抑菌率% （SZBG1）	抑菌率% （SZBG6）
BHDSJ-1	66.0	61.0
BHDSJ-3	69.4	61.0
BHDSJ-6	78.4	68.8
BHDSY-1	77.8	56.2
BHDSY-3	68.8	54.7
BHDSY-6	60.4	64.1
BHDSY-7	59.0	61.0
BHDSY-11	69.4	71.9
BHDSY-13	77.8	70.3
BHDSG-1	85.4	75.0
BHDSG-2	69.4	55.5
BHDSG-3	75.0	64.1

3. 讨 论

枯萎病的病原真菌为镰刀菌，枯萎病是危害白花丹参品质和产量的重要因素[5]，化学防治虽然有一定的成效，但也带来了化学农药的残留问题以及环境污染的问题。

研究证明部分植物的内生真菌具有抑制镰刀菌活性的作用[6]，从而能够有效防止枯萎病的产生。植物内生真菌是一种生物防控资源，其种类多，分布广，在大多数植物中都能够发现，在生物防治中具有重要的意义。

参考文献：

[1]李振兴, 单雪梅, 路立峰,等.白花丹参化学成分及其药理作用研究进展[J].人参研究, 2020, 32(03):56-58.

[2]张紫茹. 丹参化学成分研究及丹酚酸B对血栓闭塞性脉管炎大鼠的药效学评价[D].山东大学,2018.

[3]Li YL, Xin XM, Chang ZY, et al. The endophytic fungi of Salvia miltiorrhiza Bge.f alba are a potential source of natural antioxidants. Botanical Studies, 2015, 56:1-7.

[4]刘锐. 小麦赤霉病生防菌的筛选与研究[D].贵州大学,2020.

[5]杨立,缪作清,杨光,等.丹参枯萎病及其病原菌的研究[J].中国中药杂志,2013,38(23):4040-4043.

[6]王建树.拮抗尖孢镰刀菌的生物活性物质筛选与鉴定[D].中国石油大学(北京),2018.

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基金项目：国家大学生创新创业训练计划（201910439023），山东省自然科学基金项目（ZR2020MH368），泰安市科技局课题（2020NS060）

作者简介：张思尚，张潇煦为共同第一作者，主要从事生物技术制药方面研究。

通讯作者：李效良，副教授，主要从事药用植物生物技术研究。李艳玲，博士，教授，主要从事药用植物内生真菌次级代谢产物研究。