米力农细菌内毒素检查法研究

李吉娜,李后坤

摘  要:目的建立米力农细菌内毒素检查法。方法按《中国药典》2020版通则1143 细菌内毒素检查法进行，采用不同厂家的鲎试剂对不同批号的米力农分别进行方法学验证。结果在验证条件下对细菌内毒素检查法无干扰作用，米力农细菌内毒素限值可设定为10EU/mg。结论建立的方法适用于米力农的细菌内毒素检查。

关键词：米力农；细菌内毒素

米力农为磷酸二酯酶抑制剂，兼具血管扩张及强心作用，主要通过抑制磷酸二酯酶，升高心肌细胞磷酸腺苷浓度，增加钙浓度，强化心肌收缩能力，增加心排量，减轻心脏负荷，降低肺血管阻力，降低肺动脉压，改善心脏功能[1]。本文参考《中国药典》2020版通则1143 细菌内毒素检查法及2019年版中国药品检验标准操作规范[2-3]进行，对其细菌内毒素检查法进行了研究，为建立该品种细菌内毒素检查法提供科学依据。

1 方法与结果

1.1细菌内毒素限值（L）的确定

参考《中国药典》2020版二部收载的米力农注射液中内毒素限度为：每1mg米力农中含内毒素的量应小于12EU[4]，为严格控制原料药的质量，确定本品的细菌内毒素限度为：每1mg米力农中含内毒素的量应小于10EU。

1.2供试品有效浓度计算

    目前国内销售鲎试剂的灵敏度一般为0.03~0.5EU/ml，本品细菌内毒素限值10EU/mg，按公式C=λ/L计算，供试品最小有效稀释浓度Cmin=0.03/10=0.003mg/ml，最大有效稀释浓度Cmax=0.5/10=0.05mg/ml。

1.3鲎试剂灵敏度复核试验

用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品稀释成2.0、1.0、0.5、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均在漩涡混合器上混匀30秒。

取0.25EU/ml的鲎试剂18支，分别用细菌内毒素检查用水复溶，在漩涡混合器上混合30秒。其中16支分别加入0.1ml内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀，封闭管口，垂直放入37.0℃的恒温水浴锅中水浴60min。将试管从恒温水浴锅中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察结果。

鲎试剂灵敏度复核试验结果

鲎试剂批号	灵敏度（EU/ml）	细菌内毒素浓度（EU/ml）				阴性对照	λc（EU/ml）
		2.0λ	1.0λ	0.5	0.25λ
		0.5	0.15	0.125	0.0625
2004131	0.25	++++	++++	+---	---	--	0.21
2006121	025	++++	++++	++++	---	--	0.125

注：λc =antilg(ΣX/n)，其中X为反应终点浓度的对数值；n为每个浓度的平行管数。

由结果显示，表明最大浓度2.0λ管显阳性，最低浓度0.25λ管为阴性，阴性对照管为阴性，试验有效，两个厂家的鲎试剂灵敏度测定值λc均在0.5λ≤λc≤2.0λ范围内，灵敏度符合规定。

1.4干扰试验

根据干扰试验预试验结果，选用供试品溶液浓度为0.025mg/ml，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行正式干扰试验。称取三批米力农分别约100mg，先用5ml二甲基亚砜溶解、再加细菌内毒素检查用水适量，混匀稀释制成每1ml约含1mg的溶液（原液）。按最大稀释倍数（MVD=CL/λ=40）用细菌内毒素检查用水将原液逐步稀释成0.05mg/ml（20倍）、0.025mg/ml（40倍）的溶液。将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水逐步稀释成4λ（1EU/ml）、2λ（0.5EU/ml）、λ（0.25EU/ml）、0.5λ（0.125EU/ml）、0.25λ（0.0625EU/ml）。取0.025mg/ml的供试品溶液作为供试品溶液；分别取4λ、2λ、λ、0.5λ浓度的细菌内毒素工作标准品溶液与0.05mg/ml的供试品溶液进行1:1混合，得到含细菌内毒素工作标准品浓度分别为2λ、λ、0.5λ、0.25λ的0.025mg/ml供试品干扰试验系列的溶液；取2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素工作标准品溶液作为鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液；取细菌内毒素检查用水作为阴性对照溶液。

取灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂28支，分别用细菌内毒素检查用水复溶，在漩涡混合器上混合30秒。2支加入0.1ml上述供试品溶液，平行做2管（编号A）；16支加入0.1ml上述干扰试验系列的溶液，各平行做4管（编号B）；其中8支分别加入0.1ml上述鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液，各平行做2管（编号C）；2支加入0.1ml上述阴性对照溶液，平行做2管（编号D）。将试管中溶液轻轻混匀，封闭管口，垂直放入37.0℃的恒温水浴锅中水浴60min。将试管从恒温水浴锅中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察结果。

干扰试验结果

鲎试剂批号	编号(样品批号)	细菌内毒素浓度(EU/ml)				A	D	Es (EU/ml)	Et (EU/ml)
		0.5	0.25	0.125	0.0625
2004131	C	++	++	++	--	--	--	0.125
	B(Y200902)	++++	++++	----	----				0.25
	C	++	++	++	--	--	--	0.125
	B(Y200903)	++++	++++	----	----				0.25
	C	++	++	++	--	--	--	0.125
	B(Y201001)	++++	++++	----	----				0.25
2006121	C	++	++	++	--	--	--	0.125
	B(Y200902)	++++	++++	----	----				0.25
	C	++	++	++	--	--	--	0.125
	B(Y200903)	++++	++++	----	----				0.25
	C	++	++	++	--	--	--	0.125
	B(Y201001)	++++	++++	----	----				0.25

注：Es=Lg-1(ΣXs/2)、Et=Lg-1(ΣXt/4)。其中：Xs，Xt分别为鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试验系列溶液的反应终点浓度的对数值；Es，Et分别为鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试验系列溶液的反应终点浓度的几何平均值。

由表3结果可知，A和D的所有平行管均为阴性，且两个厂家鲎试剂的C的结果结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求，即Es均在0.5λ≤Es≤2.0λ范围内，试验有效。两个厂家的B的结果符合灵敏度复核试验要求，即Et均在0.5λ≤Et≤2.0λ范围内。说明取供试品约100mg，先用5ml二甲基亚砜溶解，再加细菌内毒素检查用水适量，混匀稀释制成每1ml约含1mg的溶液（原液），用细菌内毒素检查用水将原液逐步稀释成0.025mg/ml的供试品溶液时，采用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行干扰试验，结果无干扰。

1.5样品细菌内毒素检查

取3个批次的米力农原料药，分别称取米力农约100mg，先用5ml二甲基亚砜溶解，再加细菌内毒素检查用水适量，混匀稀释制成每1ml约含1mg的溶液（原液）。用细菌内毒素检查用水将原液逐步稀释成0.05mg/ml、0.025mg/ml，取0.025mg/ml作为供试品溶液，取0.5EU/ml细菌内毒素溶液与0.05mg/ml的供试品溶液进行1:1混合得到每1ml含细菌内毒素0.25EU和供试品0.025mg的溶液作为供试品阳性对照溶液。取0.25EU/ml细菌内毒素溶液作为阳性对照溶液，取细菌内毒素检查用水作为作为阴性对照。

取灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂8支，分别用细菌内毒素检查用水复溶，在漩涡混合器上混合30秒。其中2支分别加入0.1ml上述供试品溶液，平行做2管（编号A）；2支加入0.1ml上述供试品阳性对照溶液，平行做2管（编号B）；2支加入0.1ml上述阳性对照溶液，平行做2管（编号C）；2支加入0.1ml上述阴性对照溶液，平行做2管（编号D）。将试管中溶液轻轻混匀，封闭管口，垂直放入37.0℃的恒温水浴锅中水浴60min。将试管从恒温水浴锅中轻轻取出，缓缓倒转180°。观察结果。平行3批产品。

样品细菌内毒素检查结果

鲎试剂批号	样品批号	A	B	C	D
2004131	Y200902	--	++	++	--
	Y200903	--	++	++	--
	Y201001	--	++	++	--
2006121	Y200902	--	++	++	--
	Y200903	--	++	++	--
	Y201001	--	++	++	--

由结果可知，D的平行管均为阴性，B的平行管均为阳性，C的平行管均为阳性，试验有效。A的平行管均为阴性，3批供试品细菌内毒素均符合规定。

2 讨论

通过凝胶法检测供试品中细菌内毒素含量，受到多种因素的影响，如供试品的pH值、温度、离子强度、浓度等都会对细菌内毒素的检测产生干扰[5-6]。由于本品难溶于水，因此用二甲基亚砜作为辅助溶剂溶解后再用内毒素检查用水稀释。细菌内毒素的供试品干扰试验系列的结果在0.5λ≤Et≤2.0λ范围内，可认为建立的方法供试品制备过程对供试品细菌内毒素检查无干扰。

综上所述，建立的方法可用于米力农的细菌内毒素检查[7-8]。

参考文献

[1] 刘翼.米力农对老年慢性肺源性心脏病心力衰竭者血浆H2SB、BNP的影响[J].山东医药，2021,52（29）:78-80

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].四部.北京：中国医药科技出版社，2020：178-181

[3] 中国食品药品检定研究院。中国药品检验标准操作规范.北京：中国医药科技出版社，2019：484:493

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2020：492-493

[5]  高国政，颜锦.pH影响细菌内毒素测定的实验室研究[J].中国药学杂志，1998,33（3）:3

[6] 魏振洲，杜送田，石超，等。钙离子对细菌内毒素含量测定的影响[J].微生物学免疫学进展，2019,47（6）:42

[7] 曹迎亚。盐酸考尼伐坦细菌内毒素检查法的研究[J].中国药品标准，2018,19（4）；290

[8] 刘建辉，唐先明，宋丽阳，等盐酸克林霉素注射液细菌内毒素检查法的改进[J]2019,35(4);38

作者简介：李吉娜 1990.04 女 海南省 汉族 本科 助理工程师 海南辉能药业有限公司 研究方向:药学