高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠对氯虫苯甲酰胺的血浆代谢

陈慜健

摘要：建立了大鼠血浆中氯虫苯甲酰胺的高效液相色谱-串联质谱分析方法。以SD大鼠为试验对象，进行了氯虫苯甲酰胺在动物体内代谢试验，研究不同染毒剂量下氯虫苯甲酰胺原药在大鼠体内的毒代动力学特征。

关键词：氯虫苯甲酰胺；高效液相色谱-串联质谱；代谢

1引言

氯虫苯甲酰胺（C23H22F7IN2O4S）结构式见图1，作用于RyRs，通过破坏昆虫细胞质稳态环境杀虫，对哺乳动物低毒。该农药在2008年在我国获得临时登记，主要用于防治添彩夜蛾和小菜蛾。

目前国内已报道的液相色谱-串联质谱方法前处理采用提取、柱层析、反提和活性炭吸附等步骤，样品处理流程较长。本研究采用乙腈高速离心提取稀释后外标法直接进样，增进了检测效率，旨在使该农药的检测提供更高效便捷的检测方式；另外，为进一步研究该农药的毒作用机制和毒性安全研究提供科学依据。

图1 氯虫苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

岛津LC-30A/QTRAP5500液质联用仪（配备Analyst1.6.3操作软件）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；thermo多孔涡旋仪（赛默飞世尔科技股份有限公司）；LX-165T2R离心机（海尔集团），色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 μm，3.0×100 mm。

乙腈（色谱纯，Fisher公司）；甲酸（色谱纯，Fisher公司）；玉米油（益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司）；超纯水（自制）；97.65%氯虫苯甲酰胺标准品（CAS：500008-45-7，浙江埃森化学有限公司）

2.2样品的采集及前处理

取体重相近大鼠8只，分成2组，高低剂量各4只。每一只大鼠饲养于一个不锈钢笼内，按设计剂量（高剂量组1000mg/kg，低剂量组100mg/kg）开始给药，给药前禁食约18小时。以经口灌胃法一次给足设计剂量，给药容积为1 mL/100 g体重。给药后将动物放回不锈钢笼内，自由进食、饮水。高低剂量组均于给药前及给药后0.167、0.5、1、2、4、7、24、31、48、72、96 h采集血液。采集方式为大鼠眼眶静脉丛采血。血液用肝素抗凝，10000 rpm，离心10 min，取上层血浆。

取血浆适量，加入2倍量的乙腈，涡旋混匀，15000 rpm，离心10 min，取上清液适量，用80%乙腈/水溶液稀释5倍，进行仪器分析。

2.3液相色谱-串联质谱检测条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 μm，3.0×100 mm；流动相：A 0.1%甲酸水溶液，B 乙腈；流速0.6ml/min；柱温20℃；进样量2μL。

质谱条件：ESI；正离子模式，离子源温度550℃；喷雾电压5500V，碰撞气Medium；去簇电压120V；入口电压10.00V；气帘气30.00psi。定量离子对484.2/453.2Da，碰撞能30.00eV。

3.结果与讨论

大鼠单次经口染毒氯虫苯甲酰胺原药后，低（100 mg/kg）、高（1000 mg/kg）两个剂量组各时间点大鼠血浆中氯虫苯甲酰胺浓度测定结果见附表1，动物给药前血浆空白样品、血浆基质标准曲线、血浆基质标样色谱图和给药后血浆样品的色谱图见附图2-附图3。以时间为横坐标，浓度为纵坐标作浓度-时间曲线，氯虫苯甲酰胺低、高两个剂量的血浆毒-时曲线见附图4和附图5。经DAS 2.1.1软件处理，采用统计距模型计算，低、高两个剂量组的毒代动力学参数分别为Tmax：3.50 h和3.25 h；Cmax：226 μg/L和527 μg/L；MRT(0-t)：10.1 h和22.5 h；t1/2z：7.02 h和61.9 h；Vz/F：298 L/kg和13791 L/kg；CLz/F：30.4 L/h/kg和132 L/h/kg；AUC(0-t)：3463 μg/L·h和8920 μg/L·h；AUC(0-∞)：3505 μg/L·h和9743 μg/L·h。

血浆中10分钟可检出毒物；给药后低、高剂量组分别在3.50 h和3.25 h时毒物浓度达峰，随着剂量的增大达峰时间延后，达峰后随时间延长血药浓度逐渐下降，低剂量组在给药后48 h时血药浓度低于LLOQ，高剂量组在给药后96 h时血药浓度低于Cmax的5%。低、高剂量组毒时曲线下面积AUC(0-t)分别为3463 μg/L·h和8920 μg/L·h，比值为1：2.58；低、高剂量组达峰浓度Cmax分别为226 μg/L和527 μg/L，比值为1：2.33；根据AUC(0-t)和Cmax参数，氯虫苯甲酰胺经口给药后低剂量与高剂量组体内吸收与剂量不呈线性动力学关系。高剂量组吸收比例低于剂量比，高剂量组吸收达到饱和。低、高剂量组消除半衰期t1/2z分别为7.02 h和61.9 h，平均滞留时间MRT(0-t)分别为10.1 h和22.5 h，清除率CLz/F分别为30.4 L/h/kg和132 L/h/kg，表观分布容积（Vz/F）分别为298 L/kg和13791 L/kg，提示随着剂量的增加，氯虫苯甲酰胺在大鼠体内分布更广泛，其在体内的滞留时间延长，虽然剂量升高后清除加快，仍然导致半衰期明显延长。随着时间延长，血药浓度均降低至Cmax的5%以下，不存在蓄积倾向。

附表1 大鼠单次经口染毒后各时点血浆中氯虫苯甲酰胺浓度测定结果(n=4)

时间 （h）	染毒剂量100 mg/kg					染毒剂量1000 mg/kg
	1201	1202	1203	1204	平均浓度(ng/mL) (±s)	1301	1302	1303	1304	平均浓度(ng/mL) (±s)
	浓度(ng/mL)					浓度(ng/mL)
0
0.167	45.8	52.1	34.9	68.7	50.4±14	14.4	29.4	17.4	ND	20.4±8
0.5	76.6	97.1	82.9	137	98.4± 27	56.1	83.3	101	84.4	81.2±19
1	163	150	133	211	164± 34	139	266	269	124	200±79
2	161	213	172	287	208±57	528	359	315	281	371±110
4	147	141	160	318	192± 85	379	155	118	707	340±271
7	104	136	208	219	167± 56	294	112	121	906	358±375
24	24.3	150	33.9	10.7	54.7±64	120	68.9	63.0	87.1	84.8±26
31	5.50	18.6	20.8	5.00	12.5±8	21.0	29.9	32.4	134	54.3±53
48	5.00	5.00	5.00	ND	5.00±0	59.3	9.31	15.2	189	68.2±84
72	13.5	41.6	ND	ND	ND	11.0	8.62	49.9	19.1	22.2±19
96	ND	ND	ND	ND	ND	15.0	7.63	8.45	17.0	12.0±5

注：对于浓度低于定量下限的样品，在达到Cmax以前取样的样品应以无法定量（ND）计算，在达到Cmax以后第一个低于LLOQ的样品应以LLOQ计算，第二个以后低于LLOQ的样品以无法定量（ND）计算。 1201-72h、1202-72h血药浓度动力学异常，不参与TK参数统计。

附图2 大鼠单次经口染毒后毒时曲线（C-t）

附图3 大鼠经口染毒后毒时曲线（Log C-t）

参考文献：

[1] 柴宝山，林丹，等，新型邻甲酰胺基苯甲酰胺类杀虫剂的研究进展[J]，农药，2007，46（3）：148-153

[2] Battu R S,Singh B,Kooner R,Singh B.Journal of agricultural and food chemistry,2008;56(7):2299-302.

[3] Anastassiades M,Lehotay J S,Stajnbaher D,Schenck J F.Journal of AOAC International,2003,86(2):412-431.

[4] 司升云，周利琳，望勇，等。湖北省甜菜夜蛾田间种群抗药性监测[J]。植物保护，2009，35（1）：114-117.

[5] TAYLOR E D.Method for Preparing Fused Oxazinones:WO,2004011447[P].2004-02-05