单核苷酸多态性及其在畜牧兽医领域的研究进展

郭颖妍1, 潘志强2, ,王旭2  ,辛辉3, ,郝天斌4

内蒙古  赤峰市   024031内蒙古赤峰市喀喇沁旗农牧局2

内蒙古  赤峰市   024400  内蒙古赤峰市农牧科学研究所3

内蒙古  赤峰市   024031 内蒙古赤峰市动物疫病预防控制中心4内蒙古  赤峰市   024000

摘要：单核苷酸多态性(SNPs)主要指基因组DNA中特定核苷酸位置的改变，如转换、颠换、插入或缺失。序列多态性。与其他遗传标记如限制性片段长度多态性(RFLP)和微卫星标记(STRS)相比，SNP标记有两个显著的特点。SNP是基因组中的双等位基因，其等位基因频率在任何人群中都可以准确估计，便于高通量批量检测。SNPs在基因组中分布广泛，具有最丰富的遗传多样性，并且许多SNPs与生物性状的变异有关，因此它们是研究遗传变异的候选基因或位点。因此，SNP的研究有助于解释不同个体间表型性状的差异，以及不同群体和个体对疾病和环境因素反应的差异。

关键词：单核苷酸多态性；检测方法；动物；分子标记辅助育种；品种鉴定；疾病研究；

一、SNP的常用检测方法

1.测序法。测序法是SNP的经典检测方法，是最直接、最准确的方法，该方法对于发现未知的SNP十分有效，检出率可达到100%，还可区分SNP的突变碱基类型和突变位置。DNA测序技术分别经历了第一代测序技术到第三代测序技术的发展。第一代测序代表技术是Sanger发明的双脱氧链终止法（Chain Termination Method），也称为Sanger法，人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）采用的大规模测序技术正是基于Sanger法。Sanger采用的是末端终止法，目前已可测长达1 000 bp的DNA片段，对每一个碱基的读取准确率可高达99.99%。第二代测序技术意义上真正实现了高通量，测序原理为微循环阵列法，使用边合成边测序技术。主要技术平台有454焦磷酸法平台（每个测序片段长度最大500 bp）、Solexa基因组分析仪（每个测序片段长度仅为75 bp）和SOLiD高通量测序仪。SOLiD测序技术的创新点在于双碱基编码技术，即两个碱基对应一个荧光信号，每一个位点都会被检测两次，具有误差校正功能，能将真正的单碱基突变或者SNP与随机错误区分开来，降低错误率，准确率大于99.94%。第三代测序技术基于单分子读取技术，不需要PCR扩增，代表技术是单分子实时测序技术（Single Molecule Real-time DNA Sequencing，SMRT），可以对大于3 000 bp的非扩增DNA样本进行快速测序。但是，第三代测序技术所测出的结果准确率较低，SMRT技术的准确率仅约为85%，而93%的错误均是插入或缺失，并且提高单分子信号灵敏度、降低荧光背景噪音等仍是将来亟待解决的问题。

2.等位基因特异性扩增法。等位基因特异性扩增法（AS-PCR），又名ARMS。该方法设计对应SNP位点的2条特异性引物，在两管中分别与通用引物发生反应，在3引物扩增体系中，只有当3'末端碱基与等位基因互补时，延伸反应才能正常发生，由于Taq DNA聚合酶无3'→5'外切酶活性，错配的引物则不能延伸或低于正常配对未端的速度延伸，扩增产物通过电泳分离后，即可判定样本的基因型。随着技术进步，已经可以进行多重AS-PCR检测疾病的SNP位点。该方法操作简单、成本低廉、结果准确，且对试验设备要求低，在SNP检测领域显示了巨大应用潜力，AS-PCR可促进SNP检测技术由实验室向临床应用转化。不过该检测技术适于已知SNP位点的分型测点，且设计特异性引物是分型成功的关键。

3.高分辨率熔解曲线。高分辨率熔解曲线（HRM）法，通过在DNA双链中嵌入饱和荧光染料，一定温度范围内对PCR产物进行程序性升温使其变性解链进而使荧光染料脱落，实时采集荧光信号并绘制DNA熔解曲线，不同基因型扩增产物的熔解温度（Tm）不同，最终根据熔解曲线来区分突变类型，这种差异可被Real-time PCR直观地呈现在△Ct值上，该方法具有灵敏度高、特异性强、高通量和操作简便快捷等优点。该法主要用于对已知SNP位点的分型检测。由于有些基因序列的SNP位点较多，所以难点在于设计用于扩增SNP位点使产物Tm值不同的引物，缺点在于HRM法需要荧光PCR扩增系统为基础。

二、基于SNP在畜牧兽医领域的研究

1.基于SNP的动物分子标记辅助育种研究。经典育种方案通过表型筛选和谱系信息实现遗传改良，均能提高大多数现有动物品种的生产力或者抗病能力。然而，随着分子辅助育种研究的发展，发现可以选择最佳基因组合来提高物种的优良表型，可以使用DNA分子标记来绘制与数量性状相关的基因组区域（QTL），如SNP这种关联使育种中对优等个体的早期识别具有更高的精度。（1）哺乳动物的分子标记辅助育种。对235个水貂样品胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）基因的两个外显子的PCR产物进行测序筛选SNP，在3个水貂种群中检测出5个SNP差异性位点。  提高肌内脂肪含量是家畜遗传育种领域的研究热点，而探究脂肪酸结合蛋白主要家族基因SNP与八眉猪肌内脂肪含量的相关性具有重大意义。利用构建DNA混合池，采用分段扩增和直接测序法对八眉猪脂肪酸结合蛋白FABP1~4四个基因进行SNP快速筛查和生物信息学分析，在八眉猪FABPs主要家族基因中共检测出15个SNP，其中编码区有3个同义突变和2个错义突变，核苷酸突变后mRNA结构稳定性发生改变，且突变前后的mRNA二级结构以及蛋白质二、三级结构预测分析均有差异。结果表明，八眉猪FABPs主要家族基因具有较高的突变性，为研究八眉猪肌内脂肪沉积代谢过程中的调控机制及脂肪含量的遗传效应提供了分子参考依据。（2）鸟类的分子标记辅助育种。采用DNA混池测序的方法检测了黄杂鸡生长素GHRL基因启动区SNP（pSNP），检测发现，GHRL启动子起始密码子上游197位（A→G）存在1个SNP位点（c.-197A＞G），分析认为该SNP与黄杂鸡体重和体尺指标(龙骨长和胫围)密切相关，该SNP位点的不同基因型个体之间差异显著（P＜0.05），该位点可作为黄杂鸡生长发育分子标记辅助选择育种中的一个重要候选遗传标记。以209羽白羽王鸽为对象，采用PCR产物直接测序方法分析了白羽王鸽促卵泡素受体FSHR基因的SNP与产蛋量的相关性，结果表明，FSHR基因中A67801G和C76616T位点均为纯合子BB基因型时与产蛋量相关性显著（P<0.05），可作为白羽王鸽产蛋量性状选育的候选分子标记位点，为白羽王鸽分子辅助育种提供一定的参考依据。

2.基于SNP的动物品种鉴定。对太湖流域7个品种和西方5个品种猪种进行简化基因组测序，筛选出小梅山猪与其他品种猪具有5个差异的SNP位点，同时采用Sanger测序进行验证，进而建立了小梅山猪及其制品的SNP分子标记鉴定方法，可将小梅山猪与太湖流域其他6个品种及常见西方品种猪进行鉴定区分。利用5个候选位点的组合可达到鉴定概率99.35％，准确率l00％，无假阳性错判，为小梅山猪遗传资源保护和假冒伪劣品种辨别提供参考依据。

3.基于SNP的动物疾病研究。在宿主感染病原性疾病的研究中，发现最终转归情况主要受环境与遗传因素影响。以往常常把研究集中在宿主机体的疾病抵抗力反应上，而近年来，随着基因组流行病学的快速发展，研究宿主遗传因素对病原易感性的研究越来越多。（1）牛病的相关研究。用单倍型水平上SNP的差异来研究牛与副结核易感性之间的关系。研究表明,在牛的CARD15基因中，由第一个SNP的变异等位基因（C）和第二个SNP的共同等位基因（A）构成的单倍型被检测到能显著触发副结核感染，研究结果将为牛抗药性类型的选择和预测提供科学指导。在牛副结核病与CARD15基因相关性研究中，还对431头成年奶牛进行3个单核苷酸多态性位点的筛选，最终统计分析发现，研究群体中SNP 2197/C733R等位基因频率与对照组之间差异极显著性（P<0.01），在基因型分析中SNP2197/C733R与感染状态也有极显著的相关性（P<0.01）。为探索牛趋化因子受体1（CXCR1）基因编码区SNP（cSNP）与牛对牛白血病病毒（BLV）易感性之间的关系，先对某奶牛场866头荷斯坦牛BLV感染情况进行PCR检测，然后用飞行时间质谱法对CXCR1基因编码区4个特定位点SNP进行检测。检测发现，这4个特定SNP位点优势基因型分别为GG、CC、AA和GG型。分析表明，CXCR1-C.980 A>G位点对牛感染BLV的相对风险影响达到显著水平（P=0.016），且该位点GG型基因感染BLV的概率为AA型基因的5.04倍。检测的其他3个SNP位点和CXCR1单倍型对BLV易感性无显著影响（P>0.05）。结果提示CXCR1-C.980A>G位点可作为荷斯坦奶牛白血病抗病育种的分子标记之一，筛选CXCR1-C.980 A>G位点的AA型个体有助于降低荷斯坦奶牛对BLV的易感性。（2）羊病的相关研究。捻转血矛线虫对苯并咪唑类抗药性的产生是由捻转血矛线虫I型β微管蛋白编码基因的3个SNP造成的，分别是SNP-167、198、200位点核苷酸碱基突变造成虫体抗药性氨基酸的改变。对新疆伊犁某绵羊场捻转血矛线虫种群I型β微管蛋白基因苯并咪唑抗药性相关SNP进行了调查结果表明，该羊场的捻转血矛线虫种群的抗药性突变只发生在198位点和200位点，以198位点的抗药性突变为主，没有在167位点发现抗药性突变。首次从分子水平报道了新疆伊犁地区捻转血矛线虫种群I型B微管蛋白基因存在苯并咪唑抗药性突变。提醒该场及周边养殖户们适时采取更换驱虫药等相关饲养管理措施来减缓抗药性的产生和发展，避免造成巨大的经济损失。对145只哈萨克绵羊进行了布鲁氏菌虎红平板检测布鲁氏菌感染情况，以MHC-DQB2 exon3为研究对象，通过PCR-SSCP试验选取不同基因型个体进行扩增测序，探究绵羊MHC-DQB2基因exon3的SNP及其单倍型与布鲁氏菌病易感性的相关性。研究筛选了符合要求的SNP位点构建了单倍型，得到了３种与布鲁氏菌病易感性相关的单倍型，其中有２个单倍型在病例组和正常组间的差异达到了显著水平（P<0.05），１个达到差异极显著水平（P<0.01）。研究结果表明，绵羊MHCDQB2 exon3的SNP与布鲁氏菌病存在显著相关性，为开展布鲁氏菌抗性分子标记辅助选择研究提供了参考依据，为淘汰具有易感布鲁氏菌病遗传位点的抗病育种奠定了基础。（3）猪病的相关研究。用等位基因特异性聚合酶链反应（ASPCR）技术对98头大约克猪群和166头长大猪群进行2个SNP位点

总之，目前，SNP检测主要还是基于高通量测序技术，高通量测序结果准确，但大量的样本测序费用比较昂贵。相信随着未来SNP检测技术的发展与成熟，伴随着SNP检测仪器的小型化、仪器成本的降低、试剂、试剂盒的大量研发及商业化，在效率和时间上SNP检测将会更加高效迅速，基于SNP的研究，不论是在分子标记辅助育种、物种品系甚至个体间的快速鉴定、动物机体对疾病的抗性研究或个体差异化给药治疗等方面将会越来越广。

参考文献：

[1]刘萍.SNP检测方法在动物研究中的应用.2019.

[2]陈宏宇，浅谈单核苷酸多态性及其在畜牧兽医领域的研究进展.2021.