HPLC法测定美洛昔康片的含量及含量均匀度

1邢增浩,2李丹香

摘要：建立高效液相色谱法测定美洛昔康片含量及含量均匀度的方法。方法：用十八烷基键合硅胶为填充剂。以溶液A（取磷酸氢二铵2.0g加水1000ml溶解，用磷酸调节pH至7.0）-溶液B（甲醇：异丙醇（650:100）（63:37）为流动相；以碱性甲醇溶液（取40%甲醇溶液100ml，加0.4mol/L氢氧化钠溶液6ml，混匀）为稀释剂；检测波长为254nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样体积25μl。结果：美洛昔康在0.0448mg/ml～0.1344mg/ml范围内呈良好的线性关系，r=1.0000（n=5）；平均回收率为99.4%，RSD=0.5%。结论：该方法准确、快速、简便，且不受辅料干扰。

关键词：美洛昔康片、高效液相色谱法

引言

美洛昔康（Meloxicam）为新型的非甾体消炎镇痛药（NSAIDS），临床上主要用于治疗类风湿、风湿性关节炎、疼痛性骨关节炎和肌肉骨骼疾患（包括腱鞘炎、肩周炎、扭伤及各种劳损和腰痛）【1】。其结构名称为2-甲基-4羟基-N-（5-甲基-2-噻唑基）-2H-1,2-苯并噻嗪-3-甲酰胺1,1-二氧化物。目前，用于美洛昔康含量测定的方法主要有紫外分光光度法【2-4】、单扫示波极谱法【5】、高效液相色谱法【6~8】、RP-HPLC法【9-10】等，本文通过BP2018/USP40收载的美洛昔康片含量测定方法【11~12】对比及优化，建立了更简便、快捷、准确、重现性好的测定美洛昔康含量的高效液相色谱法。

1 仪器与试药

仪器：高效液相色谱仪（Waters E2695-2998 PDADetector/EmpowerTM3）；

美洛昔康片（规格：15mg）；美洛昔康对照品（含量：99.99%）均由本公司提供。磷酸二氢铵、氢氧化钠为分析纯；甲醇、异丙醇为色谱纯。

2 方法对比及优化

2.1方法对比

比较美洛昔康片含量测定HPLC法（BP2018/USP40），BP2018收载的美洛昔康片质量标准含量测定方法为梯度洗脱，但运行时间较长；USP40为等度洗脱，运行时间较短，但样品处理比较繁琐。综合考虑选择USP40收载的美洛昔康片含量测定方法，并对该方法进行优化。

2.2 流速考察

采用同一色谱柱，相同方法配制的同一浓度对照品溶液对色谱条件不同流速进行对比，由结果可知，1.0 ml/min流速出峰时间更早，拖尾因子有所改善，理论塔板数差异不大，故选择1.0ml/min流速。试验结果见表1。

表1色谱条件-流速考察结果

流速	进样测定	保留时间	拖尾因子	理论塔板
0.8ml/min	0.09mg/ml，25μl	12.54	1.55	5526
1.0ml/min	0.09mg/ml，25μl	9.24	1.45	5323

2.3 稀释剂和样品配制方法考察

2.3.1 USP原方法

稀释剂：1mol/L氢氧化钠溶液、甲醇、水。

供试品溶液：取2片样品置200ml容量瓶中，加入1mol/L氢氧化钠溶液约20ml，摇动使片剂分散，并加入160ml甲醇。超声处理约15分钟，振摇30分钟。用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液3ml至5ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3.2 优化方法

稀释剂：碱性甲醇溶液【13】（甲醇：水=40:60，加入0.4mol/L NaOH溶液6ml，混匀）。

供试品溶液：取本品20片，精密称定，研细，精密称取细粉（约相当于美洛昔康9mg），置100ml量瓶中，加稀释剂适量超声30min使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3试验结果

表2稀释剂与样品配制结果

参考方法	USP原方法		优化方法
处理方式	超声15min振摇30min		超声30min
稀释剂	1 mol/L氢氧化钠+甲醇		碱性甲醇溶液
含量（%）	102.1	101.1	102.8	102.0
平均含量（%）	101.5		102.4

试验结果显示，两种样品配制方法的含量测定结果无明显差异。优化方法易于操作且成本较少，故选用碱性甲醇溶液作为本品含量测定的稀释剂。

2.4 检测波长的选择

参照USP美洛昔康片质量标准中含量测定方法，在210nm～400nm范围内采用HPLC法和紫外吸光光度法考察美洛昔康的最大吸收波长，特征吸收波长，实验结果见表3。

表3波长选择测定结果

成分	HPLC		UV
	最大吸收波长	峰面积（254nm）	最大吸收波长	吸光度
美洛昔康	271nm/362nm	2774755	271/363	0.2165/0.3981

试验结果显示：美洛昔康在约270nm、362nm附近有最大紫外吸收，在254nm处有较大紫外吸收（峰面积约2774755），且空白溶剂及辅料在254nm处对样品的测定无干扰，参照USP含量测定法确定检测波长为254nm。

3 含量测定方法的确立

色谱条件与系统适用性用十八烷基键合硅胶为填充剂。以溶液A（取磷酸氢二铵2.0g加水1000ml溶解，用磷酸调节pH至7.0）-溶液B（甲醇：异丙醇（650:100）（63:37）为流动相；以碱性甲醇溶液（取40%甲醇溶液100ml，加0.4mol/L氢氧化钠溶液6ml，混匀）为稀释剂；检测波长为254nm；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样体积25μl。美洛昔康峰的拖尾因子不大于2.0。

测定法  取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于美洛昔康9mg)，用稀释剂溶解制成每1ml约含美洛昔康0.09mg的溶液；另取美洛昔康对照品适量，精密称定，同法溶解并定量稀释制成每lml中约含0.09mg 的溶液，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

4方法可行性研究

4.1 干扰性试验

    取本品空白辅料，照含量测定项下方法进行测定，结果表明辅料对本品含量测定无干扰（见图1）。

图1干扰试验叠加图

4.2线性关系考察

取美洛昔康对照品适量，精密称定，用稀释剂制成约0.36mg/ml的溶液，精密量取2.5、4、5、6、7.5ml，分别置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。精密量取25μl，注入液相色谱仪，测定各浓度溶液峰面积，以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，求出美洛昔康的线性方程及相关系数r，见表4。

表4 浓度与峰面积线性关系

浓度（mg/mL）	0.0448	0.0717	0.0896	0.1075	0.1344
峰面积A	1297864	2082620	2593430	3130060	3899306

经线性回归，线性方程为y=29056.7826x-3152.5483，相关系数r=1.0000。可见美洛昔康在浓度为0.0448～0.1344mg/ml的范围内，线性关系良好。

4.3精密度考察

依法平行制备6份供试品溶液。照含量测定项下方法进行测定，作为重复性结果。同时由另一名操作者，在不同日期，使用不同的仪器依法进行测定，将测得的结果与重复性试验结果进行统计（见表5）。

表5 精密度试验结果

试验	含量X(%) (Content)	平均含量（n=6）	RSD(%) （n=6）	平均含量（n=12）	RSD(%)    （n=12）
Day1            Analyst1         Equipment1	101.6	101.1	0.5	100.8	0.7
	101.3
	101.5
	100.5
	100.6
	100.9
Day2            Analyst2         Equipment2	101.4	100.5	0.7
	100.9
	100.7
	99.9
	100.2
	99.7

试验结果显示：重复性6份和中间精密度12份供试品溶液的RSD为0.7%，含量测定方法的中间精密度良好。

4.4准确度

含量测定工作浓度为0.09mg/mL，制备工作浓度70%、100%、130%的溶液，分别对低、中、高不同浓度的回收率进行考察。每个浓度上平行制备3份供试品溶液。照含量测定项下的方法测定，计算回收率（表7）。

表6溶液配制

回收率考察 溶液	空白辅料加入量（mg）	对照品加入量（mg）	容量瓶    （ml）	浓度（mg/ml）
70%	99	6.3	100	0.063
100%	99	9.0	100	0.090
130%	99	11.7	100	0.117

表7准确度测定结果

水平	理论浓度 (mg/ml)	实际浓度 (mg/ml)	回收率%	平均值（n=12）	RSD%
70%	0.064	0.064	99.2	99.4	0.5
	0.064	0.063	99.1
	0.063	0.063	100.0
100%	0.090	0.089	98.9
	0.091	0.090	99.1
	0.089	0.089	99.7
130%	0.117	0.117	99.4
	0.116	0.116	99.6
	0.117	0.117	100.0

试验结果显示：各浓度水平回收率均在98.0%-101.0%，9个样品平均回收率为99.4%，RSD为0.5%。表明本方法回收率试验良好，准确度高。

4.5溶液的稳定性

取含量测定项下的对照品溶液和供试品溶液，在室温下放置0、8、16、24、32、36h，照含量测定方法进行测定。与初始时间点相比，计算对照品溶液/供试品溶液在不同时间点峰面积的变化值（见表8）。

表8液稳定性试验结果

存放时间（h）	对照品溶液		供试品溶液
	峰面积A	绝对差值（%）	峰面积A	绝对差值（%）
0h	2614147	/	2650106	/
8h	2593698	0.8	2620472	1.1
16h	2606977	0.3	2631778	0.7
24h	2625709	0.4	2652279	0.1
32h	2631909	0.7	2655556	0.2
36h	2638634	0.9	2667017	0.6

试验结果显示，不同时间点峰面积无明显变化，故本品对照品溶液和供试品溶液36小时内稳定性良好。

5 样品的测定

5.1

含量测定

依法配制样品溶液和对照品溶液，分别取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算，结果见表11。

表11 美洛昔康片含量测定结果/以标示量计

规格	批号	含量1(%)	含量2(%)	平均含量（%）
15mg	181101	101.6	100.9	101.3
	181102	99.9	99.7	99.8
	181103	101.9	101.0	101.4

5.2 含量均匀度测定

取本品1片，置50ml量瓶中，加稀释剂适量，超声30min使溶解，放冷，用稀释剂稀释制成每1ml中约含美洛昔康0.09mg的溶液。照含量测定项依法测定（见表12)。

表12 美洛昔康片（15mg）含量均匀度测定结果

批号	含量（%）										A+2.2S
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
181101	100.8	100.7	101.0	101.2	101.5	99.2	101.0	100.8	100.0	100.6	0.63
181102	100.2	102.6	101.6	100.6	101.5	100.4	101.8	101.2	100.8	102.2	1.88
181103	101.6	100.8	101.4	100.9	101.4	102.0	102.2	102.4	102.0	101.3	1.32

参考文献

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