盐酸舍曲林潜在基因毒性杂质的研究

林先东

摘要:基因毒性杂质(或遗传毒性杂质,Genotoxic Impurity,GTI)直接或间接损伤细胞DNA,产生基因突变或体内诱变,具有致癌可能或者倾向。盐酸舍曲林作为抗抗抑郁药,对其原料药中潜在的基因毒性杂质进行全面研究具有重要的实际意义。通过对盐酸舍曲林工艺及所用原料的研究,确定盐酸舍曲林原料药中可能存在的基因毒性杂质,根据国内外法规要求制定这些基因毒性杂质合理的限度。并根据各杂质特性和工艺特点,采用合适的检测仪器和测定条件等对其残留量检测进行合规的方法学验证。

一、.概述

根据现相应法规要求，对盐酸舍曲林合成中涉及到的原料，溶剂，中间体，成品、工艺杂质、降解杂质等进行诱变性的评估。并依据ICH M7 诱变性杂质的控制策略进行控制。

二、盐酸舍曲林及起始物料合成工艺

1、盐酸舍曲林工艺

1.1、合成路线

以舍曲酮为起始原料，经柳卡尔特反应、碱水解反应、成盐等步骤得顺式-盐酸舍曲林，以顺式-盐酸舍曲林母液为原料，经浓缩、游离、消旋得消旋-顺式盐酸舍曲林，顺式-盐酸舍曲林与消旋-顺式盐酸舍曲林再经游离、拆分精制等步骤得盐酸舍曲林成品。

1.2、工艺中使用的溶剂/试剂：

工艺溶剂：N-甲基甲酰胺、正丁醇、甲苯、饮用水、食用酒精、无水乙醇、氯化氢乙醇、乙酸乙酯；

试剂：甲酸、氢氧化钾、精制盐酸、液碱、氢氧化钠、D-扁桃酸、二甲基亚砜、浓硫酸；

2、起始原料舍曲酮工艺

2.1、合成路线：

2. 2工艺中使用的溶剂/试剂：甲醇。

三、评估软件

1.1评估软件

ICH M7指南中指出，可采用（Q）SAR方法对所有物质进行毒性评估，根据预测的结果，制定相应的控制策略。预测时，要使用2个相互互补的(Q)SAR预测方法对物质进行评估，一个方法应是依据专家规则（Expert rule based），另一个方法则应该是基于统计方式（Statistical-based）的方法。

1.2软件信息

根据ICH M7中要求，选取了2款软件对盐酸舍曲林合成过程中涉及的物质进行评估，软件信息如下：

1)Toxtree V2.6.1（基于专家和统计学的软件）

评估方法：

决策树A：通过鉴别分析和结构规律预测其致癌性和致突变性的可能性(Predicts the possibility of carcinogenicity and mutagenicity by discriminant analysis and structural rules.)

决策树B：ISS数据库-体外诱变毒性警示(Ames试验)（Toxic by in vitro mutagenicity(Ames test) alert by ISS）

2)VEGA（基于统计学的评估软件）

诱变模型：

Mutagenicity(Ames test) model CARSAR V.2.1.13；

Mutagenicity (Ames test) model SarPy/IRFMN V.1.0.7；

Mutagenicity(Ames test) ISS V.1.0.2；

Mutagenicity(Ames test) KNN/Read-cross V.1.0.0.

综上：使用两种软件对盐酸舍曲林合成路线中涉及的物质进行评估，根据评估结构，制定相应的控制策略。

四、潜在的基因毒性杂质分析结果

结合上述盐酸舍曲林的合成工艺和起始原料的合成工艺（舍曲酮），依据ICH M7提供的潜在警示结构，我们使用软件分析潜在的基因毒性杂质结果如下：

1、原料和中间产品

分析结果：

工艺中所有使用的原料（试剂、溶剂、催化剂）和中间产品（包括反应的过渡态）经分析无警示结构。

2、工艺杂质

分析结果：

扁桃酸盐精品再次成盐过程中使用的溶剂无水乙醇、氯化氢乙醇中的乙醇和盐酸反应产生氯乙烷。

顺式盐酸舍曲林和消旋顺式盐酸舍曲林成盐过程中使用的盐酸与正丁醇反应产生氯代正丁烷。

起始原料舍曲酮残留溶剂甲醇与拆分过程使用的浓硫酸反应产生硫酸二甲酯。

拆分步骤残留浓硫酸与乙醇、氯化氢乙醇中的乙醇反应产生硫酸二乙酯。

3、降解杂质

无

五、评估软件结果

表1：评估软件结果

杂质结构	来源	Toxtree		Vega				ICH M7分类
		决策树A	决策树B	CAESAR	SarPy	ISS	KNN
氯乙烷	工艺杂质	警示结构：脂肪族卤素	警示结构：脂肪族卤素	有实验数据表明有诱变性				2类
氯代正丁烷	工艺杂质	警示结构：脂肪族卤素	警示结构：脂肪族卤素	有实验数据表明无诱变性				3类
硫酸二甲酯	工艺杂质	有致癌性数据						1类
硫酸二乙酯	工艺杂质	有致癌性数据						1类

六、控制策略

根据合成工艺分析，共识别出中含警示结构的杂质有4个，经过基于（Q）SAR方法软件评估，其中属ICH M7中定义第一类杂质2个，第二类杂质的1个，第三类杂质的1个。

对于ICH M7中规定的具有致癌性数据的第一类、诱变性数据的第二类和无诱变性数据的第三类，根据ICH M7中的控制方法，以及杂质的化学稳定性、杂质性质、杂质产生的阶段、杂质类型、杂质产生后到API之间的化学反应和纯化步骤类型；以及产生后到API生成之间有多少反应步骤等，采取最终的控制策略。

表2： 控制策略

序号	名称	来源	距API步骤	性质	去向	采用ICH 方法	控制策略
	C2H5Cl 氯乙烷	扁桃酸盐精品再次成盐过程中使用的溶剂无水乙醇、氯化氢乙醇中的乙醇和盐酸反应	1步精制步骤	气体	由于该杂质为气体，容易在产品结晶和干燥过程中被清除，即该杂质在盐酸舍曲林精品的精制过程中被除去。	方法1	我们在工艺验证3批次检测成品中的氯乙烷，工艺验证3批DK72-2105281、DK72-2105282、DK72-2105291的检测结果依次为6 ppm、9 ppm、8 ppm（氯乙烷标准限度为：2000ppm，LOQ为5ppm），检测结果均低于标准限度的10%，确定采用ICH M7中控制策略1的可行性。
	C4H9Cl 氯代正丁烷	顺式盐酸舍曲林和消旋顺式盐酸舍曲林成盐过程中使用的盐酸与正丁醇反应	2步化学反应和3步精制步骤	液体	由于该杂质为液体，容易在产品结晶和干燥过程中被清除，即该杂质在扁桃酸盐粗品的制备过程、扁桃酸盐粗品的精制过程以及盐酸舍曲林精品的精制过程中被除去。	方法4	我们在工艺验证3批次检测成品中的氯代正丁烷，工艺验证3批DK72-2105281、DK72-2105282、DK72-2105291的检测结果均为未检出（氯代正丁烷标准限度为：200ppm，LOQ为6ppm），确定采用ICH M7中控制策略4的可行性。
	C2H6O4S 硫酸二甲酯	起始原料舍曲酮残留溶剂甲醇与拆分过程使用的浓硫酸反应产生硫酸二甲酯。	1步化学反应和3步精制步骤	液体	由于该杂质为液体，容易在产品结晶和干燥过程中被清除，即该杂质在扁桃酸盐粗品的制备过程、扁桃酸盐粗品的精制过程以及盐酸舍曲林精品的精制过程中被除去。	方法4	我们在工艺验证3批次检测成品中的硫酸二甲酯和硫酸二乙酯，工艺验证3批DK72-2105281、DK72-2105282、DK72-2105291的硫酸二甲酯检测结果均为未检出（硫酸二甲酯标准限度为：7.5ppm，LOQ为0.8ppm），硫酸二乙酯的检测结果依次为0.2 ppm、0.3 ppm、0.2 ppm（硫酸二乙酯标准限度为：7.5ppm，LOQ为0.7ppm），硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的检测结果均低于标准限度的10%，确定采用ICH M7中控制策略4的可行性。
	C4H10O4S 硫酸二乙酯	拆分步骤残留浓硫酸与乙醇、氯化氢乙醇中的乙醇反应产生硫酸二乙酯。	1步化学反应和2步精制步骤	液体	由于该杂质为液体，容易在产品结晶和干燥过程中被清除，即该杂质在扁桃酸盐粗品的精制过程以及盐酸舍曲林精品的精制过程中被除去。
经过查询，氯乙烷含有脂肪族卤素这个基因毒性杂质的警示结构，有实验数据表明其含有诱变性{1~5}，氯乙烷的TD50为1810mg/kg/day，根据遗传毒性杂质可接受摄入量计算公式可知，氯乙烷的每日可接受摄入量ADI=TD50/50000*50kg=1810/50000*50=1.81mg，盐酸舍曲林的最大日剂量为200mg，因此，盐酸舍曲林中氯乙烷的最大允许残留量=1.81/200*100%=0.905%=9050ppm。 根据US/EPA数据库，氯代正丁烷RfD为0.04mg/kg/天，按照人类体重50kg计算。PDE=0.04mg/kg/天×50kg=2.0mg/天。根据1000*2.0/10*100%=200ppm，故按限度不得过200ppm进行研究。 按TTC计算的杂质残留限度：基因毒性类化合物每日允许摄入量的最严值为1.5μg，盐酸舍曲林的最大日摄入量为0.2g，因此可以计算出盐酸舍曲林中潜在基因毒性杂质硫酸二甲酯和硫酸二乙酯的安全限度为：1.5÷（0.2×106）×100%=7.5ppm。

七、参考文献

1)SIMMON,VF, KAUHANEN,K AND TARDIFF,RG; MUTAGENIC ACTIVITY OF CHEMICALS IDENTIFIED IN DRINKING WATER; DEV. TOXICOL. ENVIRON. SCI. 2:249-258, 1977.

2)ANDREWS,AW, ZAWISTOWSKI,ES AND VALENTINE,CR; A COMPARISON OF THE MUTAGENIC PROPERTIES OF VINYL CHLORIDE AND METHYL CHLORIDE; MUTAT. RES. 40:273-276, 1976.

3)JAPAN CHEMICAL INDUSTRY ECOLOGY- TOXICOLOGY AND INFORMATION CENTER, JAPAN; MUTAGENICITY TEST DATA OF EXISTING CHEMICAL SUBSTANCES BASED ON THE TOXICITY INVESTIGATION OF THE INDUSTRIAL SAFETY AND HEALTH LAW; (SUPPL), 1997

4)NCI/NTP CARCINOGENESIS TECHNICAL REPORT SERIES; NATIONAL CANCER INSTITUTE/NATIONAL TOXICOLOGY PROGRAM; U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, TR-346 Y89.