离子交换层析在蛋白纯化中应用的关键控制要求及问题解析

康秀超

摘要：离子交换层析(ion-exchange chromatography,IEC) 是在生物大分子提纯中得到最广泛应用的方法之一。离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素)和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。本文主要分析离子交换层析在蛋白纯化中应用的关键控制要求，并针对具体问题，采取相应解决措施。

关键词：离子交换层析、蛋白纯化、关键控制要求、问题解析

引言：离子交换层析法是根据电荷特性分离生物分子的一种蛋白纯化方法,由于该法操作简易，分辨率高且通量大，迅速成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方法。离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法的应用很广泛。

一、离子交换层析的基本原理

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂;而带有正电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。有许多离子交换介质都已经商品化，但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小（即目的蛋白和污染物），以及可得到的装备（如泵和柱子）。

首先需要选择阴离子或阳离子介质，如果目的蛋白的等电点已知，选择阴离子介质且操作的pH高于目的蛋白的pI，或选择阳离子介质且操作pH低于目的蛋白的pI。如果靶蛋白的pI未知，开始之前最好先测定它。最佳操作pH可根据经验确定。因为大多数蛋白质的pI低于7，选择阴离子交换和操作pH为8.5开始是合理的，然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物pI和结合特征也是有用的。

二、离子交换层析常见问题解析：

问题	可能的原因	解决方案
在盐梯度中蛋白质不能洗脱	缓冲液的pH不对、盐浓度太低	使用pH更靠近蛋白质pI的缓冲液、使用更浓的洗脱缓冲液。
蛋白质出现在清洗相中	结合缓冲液的盐浓度太高、样品的盐浓度太高或pH错误、柱子没平衡好、离子变性剂或其他添加剂、结合到柱子上。	降低结合缓冲液的盐浓度、更换样品的缓冲液、重复或延长平衡时间直到电导恒定、清洗柱子。
分辨率比预想的要低	梯度斜率太抖、流速太高、蛋白质或脂质沉淀到柱子上、样品上样前没有恰当过滤蛋白形成聚合体、凝胶紧密结合、 柱子安装不好、检测仪的流动池或柱中或柱后的混合体积太大。	使用更平缓的梯度或增加一个平台、较低的流速下分离 清洗和再生柱子。再生柱子、过滤样品、重复层析使用脲素或变性剂清洗柱子、运行有色的化合物观察条带检测装柱效果，如有必要重装柱子、 更换流动池或减小柱后体积。
层析图中峰形前拖尾或太圆	柱子超载、柱子没装好、柱子需要再生。	降低样品的上样量，重复试验。运行有色的化合物观察条带检测装柱效果，如有必要重装柱子。清洗再生柱子，如果这样还不行，换一个新的。
层析图汇总峰形拖尾	样品太黏、柱子的滤器上或凝胶床的顶部发生了蛋白沉淀、柱子装的不好。	减低蛋白质的量，从样品中出去核酸清洗柱子，更换或清洗滤器。
获得的蛋白质量正常但活性低	靶蛋白在洗脱缓冲液中不稳定，因而失活了酶与辅酶或对其活性是必需的因子分离、 柱子上有微生物生长。	变换洗脱条件、收集所有的组分进行测定并重复试验、清洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶。
洗脱级分中蛋白质的量比预想的少得多	蛋白质被蛋白酶降解、在样品的准备中蛋白质吸附到过滤器上、柱子上有微生物生长。	在缓冲液中加蛋白酶抑制剂、 使用其他型号的滤器并在缓冲液中加变性剂、清洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶。

三、离子交换层析规范化操作

（一）预处理和装柱

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用"碱-酸-碱"处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂;对于阳离子交换剂则用"酸-碱-酸"处理，使最终转为-H-型交换剂。

洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

（二）洗脱

已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱。两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

洗脱时应满足以下要求:洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤；梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来；梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽

（三）层析柱

离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。

（四）平衡缓冲液

离子交换层析的基本反应过程就是离子交换剂平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液、洗脱缓冲液的离子强度和pH值的选择对于分离效果有很大的影响。平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。

（五）上样

离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5%为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。

（六）洗脱缓冲液

梯度洗脱通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，所以多数会采用梯度洗脱方法梯度洗脱。梯度洗脱可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。

结束语：

离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。这种方法具有成本低、设备简单、操作简单等众多优点，已成为生物大分子提纯的有效方法之一，但是同样也存在一些缺点，如生产周期长、产品质量差等。现代化不断发展，科技日新月异，离子交换层析也需要随时代发展不断做出完善，加强技术处理，规范具体操作，推动今后蛋白纯化技术更加完善。

参考文献:

[1]陈新朋,匡青芬,罗二华,梁小明,刘敏亮,龚佳莉.一步离子交换层析制备人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ蛋白液[J].中国输血杂志,2020,33(11):1147-1150.DOI:10.13303/j.cjbt.issn.1004-549x.2020.11.008.

[2]杨敬,翁秀芳,梁智辉,吴雄文.通过两步离子交换层析建立保留HLA-A2二聚体构象的纯化方法[J].华中科技大学学报(医学版),2020,49(03):301-306+311.

[3]李雯露. LB膜模拟离子交换层析界面研究食用胶原蛋白肽吸附作用[D].山东农业大学,2016.

[4]何传波,魏好程,熊何健,吴国宏.枇杷叶多糖酶法提取工艺优化及其离子交换层析纯化[J].食品科学,2016,37(08):45-50.

[5]牟蕾,鲁涛,王黔川,李伟,余伟.一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选[J].中国生物制品学杂志,2015,28(11):1206-1210.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.001149.

[6]杨莲花. 凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗[D].吉林大学,2015.

[7]王琼秀,周菁.离子交换层析法纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白[J].中国药业,2013,22(10):51-53.

[8]张莉丽,张兰威,杜明,韩雪,易华西,张英春,张艳禾,马微.凝胶层析和离子交换层析结合法纯化高盐发酵液中谷氨酰胺转胺酶[J].分析化学,2012,40(08):1225-1230.

[9]孙西艳. 重组药用蛋白离子交换层析分离过程介质的污染机理及其控制策略[D].北京化工大学,2011.

[10]汤伟,彭求贤,严愉妙,莫志贤,黄少慧,李欣,蔡红兵.大孔吸附树脂法及离子交换层析柱法精制纯化丹参多糖的研究[J].中药材,2010,33(12):1937-1941.DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2010.12.037.

[11]陈少谦,孙艳虹,曾智杰,刘敏. 氨甲酰血红蛋白在两类糖化血红蛋白检测系统中的影响[C]//.广东省生物医学工程学会成立30周年纪念大会暨2010广州（国际）生物医学工程学术大会论文集.,2010:235-236.

[12]胡鹏,罗欣,杜方岭.DEAE-Sepharose-FF离子交换层析对牛背最长肌中钙激活酶的纯化研究[J].农产品加工(创新版),2009(10):43-45+59.

[13]刘晓宇,肖淑英,刘志刚,姚敏,孟光.短穗鱼尾葵及长穗鱼尾葵花粉过敏原的分析、鉴定与纯化[J].热带医学杂志,2007(10):952-955+977.

[14]陈斌,黄庆,府伟灵.离子交换层析微柱法及亲和电泳法与液相色谱分析法对糖化血红蛋白含量测定的比较[J].第三军医大学学报,2001(09):1124-1125.

[15]贺侯转,赵建英.发酵液中L——谷氨酸酰胺含量的离子交换层析化学测定法[J].山西食品工业,1996(02):34-35.