高敏HBV-DNA 实时荧光定量 PCR 检测试剂性能评价

熊敏

【摘要】 目的评估实时荧光定量 PCR 法检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA)核酸检测试剂的分析性能及结果的临床应用价值。 方法 采用咸宁市中心医院收集的高浓度阳性患者标本和国家卫生部临检中心和湖北省临检中心的室间质控样品,对乙型肝炎病毒(HBV-DNA)检测试剂的精密度,正确度,检测限，分析测量范围等性能参数进行性能验证和评估。 结果 高浓度(10⁵IU/mL)和低浓度(10³IU/mL)的精密度CV均≤5% ,正确度的检测结果符合国家卫生健康委临床检验中心和湖北省临床检验的室间质评要求。 检测下限( 功能灵敏度) 可达到 30I U/ ml,且重复间的 CV 值≤20% ;在 在 30IU/mL≤HBV DNA≤1.0×10⁸IU/mL，分析测量范围线性关系良好(线性关系系数 R² = 0. 99)。 结论 定量项目检测正式用于检测临床前必须对检测系统的分析性能做充分的评估。通过实验室验证HBV-DNA实时荧光定量PCR检测试剂可以满足目前乙肝的筛查和临床疗效监测的需求,并且检测过程经济简便,适用于临床的常规检测。

【关键词】 乙型肝炎病毒(HBV-DNA);核酸检测;性能验证

【关键词】 乙型肝炎病毒(HBV-DNA);核酸检测;性能验证

中国HBV感染者约9000万例，居于全球之冠^[1]。HBV-DNA检测对乙型肝炎的诊断、治疗过程监测及预后判断都起到重要的指导作用，检测系统性能决定检测结果质量，影响着临床诊断、治疗和预后^[2]。目前各国医学实验室相关法规已将检验方法和检测系统性能验证纳入实验室的管理要求和技术要求的范围内^[3]。传统以检测血清感染标志物来判定HBV感染，无法对患者HBV感染复制作出判断。乙型肝炎病毒核酸DNA定量检测技术便于对患者体内HBV复制及传染性有更直接的了解。HBV-DNA阳性作为HBV复制的最可靠指标，也是反映乙肝的感染状态和治疗效果的重要指标，临床上通过直接检测病毒的数量水平真实地反映病毒的感染情况，从而对HBV进行准确诊断、有效治疗、精确预后及新药研制等方面具有重大意义。 本实验根据《医学实验室质量和能力认可准则》（CNAS-CL36:2012） 《分子诊断检验程序性能验证指南》（CNAS-GL039：2019）《核酸检测试剂盒质量评价技术规范》的要求，对本实验室HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统制定了性能验证方案，包括精密度、线性范围、正确度、检测限（灵敏度）、抗干扰能力。以评价检测系统是否符合YY/T1182—2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》 要求，应用于临床检测工作。

1 材料与方法

1.1 样本来源

高浓度样本来源于本院乙肝患者乙型肝炎病毒定值混合血清。室内质控品购自北京康彻思坦公司，该质控品可溯源至 至 GBW（E）090139、GBW （E）090138。

室间质评样本来自于国家卫健委临床检验中心及湖北省临床检验中心考核样本。稀释用血清为小牛血清。

1.2 仪器与试剂

天隆TL988荧光定量基因扩增仪，GeneRotex96全自动核酸提取仪、提取试剂为西安天隆DNA/RNA通用提取试剂（批号20081110T324）、乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂及标准品均购于西安天隆技术有限公司（批号：2018004）

1.3 方法

1.3.1 HBV-DNA 提取、扩增

Natchs 全自动核酸提取仪严 格按照《乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针 扩增程序：95 ℃，3 min，1个循环；94 ℃、15 s，60 ℃、30s，共45个循环；，60 ℃采集检测样本（FAM）和内标（HEX/VIC）荧光。

1.3.2 验证指标及验证方法

(1)精密度验证：

将HBV临床样本（浓度值：10⁸IU/ml），使用HBV阴性血清（或小牛血清）稀释高低两个浓度的HBV样本（Jg、Jd），其中高浓度样本（Jg）浓度值在10⁵ IU/ml浓度范围内，低浓度样本（Jd）浓度值在10³ IU/ml浓度范围内，每个样本重复检测10次。计算两浓度样本对数值变异系数（CV），应符合检测浓度对数值的 CV＜5%，反之检测系统性能评估不通过。

(2)准确度验证：

准确度是指在一定的条件下多次测定的平均值与真值相符合的程度,用来衡量系统误差的指标。：对参加的湖北省室间质评和卫生部室间质评标本进行检测，按照临床检验中心的判断标准，结果在小于靶值对数值±0.4为通过。

(3)检测限验证:检测限是指样品中分析物的最小量,可以在规定的可能性条件下予以检出。将HBV临床样本（浓度值：1.0E+04IU/ml）使用HBV阴性血清（或小牛血清）以10倍浓度梯度稀释至10 IU/ml，重复检测25次，统计检出率。判断标准：应满足检测限样本检出率满足≥95%；

(4)线性范围验证:线性范围(临床可报告范围) 是指阳性定值样本经过稀释或其他预处理的方式而间接获得的分析物值的范围。将高浓度阳性定值样本进行系列梯度稀释至 30I U/ ml,对高浓度样本和稀释后的样本进行同批次检测,每个样本重复检测 3 次,计算相关系数 R2,如果 R2 ≥ 0. 98,则线性范围评估通过。稀释方法请见表1

表 1：线性范围样本建议稀释方法

样本名称	浓度 （IU/mL）	高浓度样本体积（uL）	阴性血清体积（uL）	总体积	E8汇总（uL）	阴性血清汇总（uL）
E8	1.00E+08	E8，1000	0	1000	1000	6000
E7	1.00E+07	E8，100	900	1000
E6	1.00E+06	E7，100	900	1000
E5	1.00E+05	E6，100	900	1000
E4	1.00E+04	E5，100	900	1000
E3	1.00E+03	E4，100	900	1000
E2	1.00E+02	E3，100	900	1000
E1	3.00E+01	E2，300	600	900

(5)抗干扰能力验证：验证方法：将两例HBV临床样本（浓度值：104IU/ml、106IU/ml）,分别与各干扰物的10倍浓度母液、阴性血清，按照1:1:8进行稀释后的样本作为各干扰物检测样本；同时将此两例样本，分别使用阴性血清，按照1:9进行稀释，稀释后的样本作为对照样本。上述检测样本、对照样本，重复检测三次，统计检测结果对数值。合格标准：干扰物稀释的测定浓度对数均值与阴性血清稀释的测定浓度对数均值差在±0.5log范围内；

(6)交叉污染与携带污染验证

实验方案：选取浓度约为10⁷IU/ml以及10²IU/ml的临床血清样本，按照96孔板的提取摆放顺序，高值（10⁷IU/m）与阴性（阴性小牛血清）交叉摆放6组，高值（10⁷IU/m）与低值（10²IU/ml）样本交叉摆放6组 2、实验评价合格标准：各组的阴性对照不应出现扩增，2次方的临床血清样本应符合原值浓度。

(7)定量限验证：验证方法：将HBV临床样本（浓度值：10⁴IU/ml）使用HBV阴性血清（或小牛血清）以10倍浓度梯度稀释至30 IU/ml，重复检测20次，统计检测结果对数值。合格标准：重复20次的检测结果符合±0.4个对数数量级。

2结果

2.1精密度验证 HBV-DNA检测系统精密度检测结果见表2，两浓度样本对数值变异系数（CV），符合检测浓度对数值的CV＜5%，

表2精密度结果统计

检测次数	样本名称	检测浓度值	浓度对数值	样本名称	检测浓度值	浓度对数值
1	Jg	1.13E+03	3.05	Jd	1.38E+05	5.14
2		1.20E+03	3.08		1.33E+05	5.12
3		1.39E+03	3.14		1.41E+05	5.15
4		1.61E+03	3.21		1.19E+05	5.08
5		1.50E+03	3.18		1.11E+05	5.05
6		1.47E+03	3.17		9.98E+04	5.00
7		1.38E+03	3.14		1.15E+05	5.06
8		9.24E+02	2.97		1.18E+05	5.07
9		1.15E+03	3.06		1.35E+05	5.13
10		5.49E+02	2.74		1.38E+05	5.14
/	均值	/	3.07	均值	/	5.09
/	CV%	4.47		CV%	0.99

2.2 准确度验证 参照国家卫生健康委临床检验中心室间质评结果,见表3。以及湖北省临床检验中心核酸检测(病毒学)室间质评结果，见表4 。

表3 全国临床实验室核酸检测室间质评结果

样本编号	你室结果	结果对数	靶值	上下限	评价结果
2 02011	6.01E+03	3.78000	3.57000	3.17-3.97	通过
202012	3.80E+04	4.58000	4.67000	4.27-5.07	通过
202013	0	0.00000	0.00000	-1.00--1.00	通过
202014	7.04E+04	4.87000	4.92000	4.52-5.32	通过
2 02015	2.01E+04	4.30000	4.30000	3.90-4.70	通过

表4湖北省临床检验中心临床基因扩增室间质评结果

样本编号	你室结果	结果对数	均值	SD	上下限	靶值	评价结果
2 01921	2.55E+04	4.41000	4.13500	0.134	3.63000-4.63000	4.13	通过
201922	2.98E+05	5.47000	5.28600	0.172	4.78600-5.78600	5.286	通过
201923	6.66E+03	3.82000	3.43600	0.168	2.94200-3.94200	3.442	通过
201924	6.01E+04	4.78000	4.46700	0.155	3.97100-4.97100	4.471	通过
201925	5.03E+03	3.70000	3.42200	0.148	2.92300-3.92300	3.423	通过

2.3检测限验证 将HBV临床样本（浓度值：1.0E+04IU/ml）使用HBV阴性血清（或小牛血清）以10倍浓度梯度稀释至10 IU/ml，重复检测25次，检出24次，检出率96%。满足检测限样本检出率满足≥95%的要求。HBV-DNA检测系统检测限验证结果见表4

表4 检测限结果统计

样本名称	检测次数	检测结果		检出率
		检测浓度值	是否检出
检测限样本	1	3.68E+01	是	96%
	2	3.71E+01	是
	3	4.07E+01	是
	4	3.76E+01	是
	5	4.27E+01	是
	6	3.76E+01	是
	7	3.75E+01	是
	8	3.74E+01	是
	9	3.68E+01	是
	10	3.65E+01	是
	11	3.83E+01	是
	12	3.73E+01	是
	13	3.88E+01	是
	14	3.72E+01	是
	15	3.69E+01	是
	16	3.69E+01	是
	17	3.67E+01	是
	18	3.74E+01	是
	19	-	否
	20	4.05E+01	是
	21	3.72E+01	是
	22	3.73E+01	是
	23	3.67E+01	是
	24	3.67E+01	是
	25	3.69E+01	是

2.4线性范围验证 线性范围结果统计见表5 表6

表 5：线性范围结果统计

样本名称	检测结果			对数均值	线性相关系数
	重复一	重复二	重复三
E8	1.904E+08	2.144E+08	2.181E+08	8.32	0.997
E7	2.188E+07	1.921E+07	1.921E+07	7.30
E6	1.554E+06	1.917E+06	1.546E+06	6.22
E5	1.377E+05	1.578E+05	1.698E+05	5.19
E4	1.763E+04	1.462E+04	1.446E+04	4.19
E3	8.665E+02	1.303E+03	1.045E+03	3.02
E2	9.904E+01	1.423E+02	1.256E+02	2.08
E1	3.594E+01	3.935E+01	2.183E+01	1.50

验证30～1.0×10⁸IU/mL，线性范围符合YY/T 1182 —2010《核酸扩增检测用试剂（盒）》相关系数R2≥0.98。

3 讨论

本研究显示，高浓度(10⁵IU/mL)和低浓度(10³IU/mL)的精密度CV均≤5% ,正确度的检测结果符合国家卫生健康委临床检验中心和湖北省临床检验的室间质评要求。检测下限( 功能灵敏度) 可达到 30I U/ ml,且重复间的 CV 值≤20% ;在 在 30IU/mL≤HBV DNA≤1.0×10⁸IU/mL，分析测量范围线性关系良好(线性关系系数 R2 = 0. 99)。

综上所述， 定量项目检测正式用于检测临床前必须对检测系统的分析性能做充分的评估。通过实验室验证HBV-DNA实时荧光定量PCR检测试剂可以满足目前乙肝的筛查和临床疗效监测的需求,并且检测过程经济简便,适用于临床的常规检测。

参考文献

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[2] 仲崇明,曾健,刘婷婷,等.HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系 统性能验证[J]. 中国卫生检验杂志, 2015, 25(14): 2362- 2366.

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CNAS,2012.