高效液相色谱法测定血清万古霉素浓度

林 盛 邱国栋 郑洁婷 佘玉奇通讯作者

[摘要] 目的：建立万古霉素高效液相色谱方法，作为临床常规检测项，促进临床用药安全性。方法：内标：齐多夫定，色谱柱：Poroshell EC-C₁₈（3.0×150mm，2.7μm），流动相：乙腈-水溶液（含30mM甲酸铵，调pH3.18），体积比9:91，流速0.4mL/min，检测波长250nm，柱温40℃。结果：万古霉素在2~50μg/mL范围内线性良好，准确度及精密度符合要求。结论：该方法适用于临床监测万古霉素血药浓度。

[关键词] 万古霉素；血药浓度监测

万古霉素是一种糖肽类抗菌药，用于治疗革兰氏阳性需氧菌感染，《中国万古霉素治疗药物监测指南》推荐重症监护病房患者、应用肾损害药物及肾功能不全的患者进行浓度监测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

万古霉素对照品（中国食品药品检定研究院）；齐多夫定对照品（阿拉丁）；乙腈（迈瑞达）；其他试剂为分析级。

高效液相色谱仪（日本岛津，包括LC-20ADXR输送泵、SPD-20A紫外检测器）；pH计（上海仪电）；空白血清由检验科提供。

1.2 血药浓度测定

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Poroshell EC-C₁₈（3.0×150mm，2.7μm），流动相：乙腈-水溶液（含30mM甲酸铵，3mL甲酸调pH3.18），体积比9：91；流速0.4mL/min；检测波长250nm；柱温40℃；进样量10μL；分析时间13.5min。

1.2.2 标准曲线和质控的配制 取万古霉素对照品适量，以水定容配制5mg/mL储备液，4℃贮存。储备液以水逐级稀释成40~1000μg/mL梯度工作液，与空白血清1:19配制2~50μg/mL标准曲线样品。按照以上步骤配制6μg/mL、24μg/mL、40μg/mL的低中高浓度质控样品。内标临用前以水配制0.25mg/mL工作液。

1.2.3 血清样品处理 取血清样品200μL，加入内标工作液10μL、水200μL和乙腈600μL，涡旋5s，14500rpm离心3min，取上清850μL至玻璃管，55℃加热，氮气吹干，残渣加入200μL流动相溶解，经针式过滤至进样瓶。

1.3 方法学考察

1.3.1 选择性 通过比较色谱图：①6批空白血清；②31种常用的外源性药物（长春新碱、奥氮平、头孢哌酮、托烷司琼等）；③定量下限血清样品。干扰低于定量下限响应的20%并低于内标响应的5%时可以接受。

1.3.2 线性和范围 6个不同校正浓度评价3条标准曲线。以峰面积比值对标示浓度进行最小二乘法回归，加权系数1/A²，得相应方程。

1.3.3 准确度与精密度 配制四个不同浓度水平的样品，每个浓度水平6份，一共3批，按1.2.3处理，批内批间准确度及精密度偏差应在±15%范围内（定量下限在±20%范围内）。

1.3.4 稳定性 每个质控浓度水平3份，一共3批，分别评估在4℃放置10天、样品处理后在室温放置24小时、反复冻融三次的稳定性，偏差应在±15%范围内。

2 结果

2.1 选择性 万古霉素保留时间5.7min，内标保留时间11.8min，均未观察到干扰。

A

B

C

A：空白血清样品；B：定量下限血清样品；C：临床血清样品；

图1 万古霉素和内标色谱图

2.2 线性与范围 Y=0.0175259X-0.00187096，r=0.995，线性良好。

2.3 准确度与精密度 见表1，符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》的要求。

表1 万古霉素批内批间的准确度与精密度（n=6）

标示浓度（μg/mL）	批内			批间
	测定浓度（μg/mL）	准确度%	精密度%	测定浓度（μg/mL）	准确度%	精密度%
2	2.00±0.16	100.12	8.18	1.97±0.23	98.74	11.85
6	5.92±0.32	98.63	5.36	6.25±0.40	104.11	6.46
24	24.32±0.86	101.33	3.53	24.67±1.05	102.78	4.25
40	40.67±2.22	101.67	5.45	40.63±2.73	101.57	6.73

2.4 稳定性 质控准确度91.44%~106.57%，精密度1.51%~4.57%，说明本实验的储存条件均不影响测定结果。

3 讨论

3.1 流动相的选择 先后采用乙腈-磷酸二氢钾缓冲液^[1]和甲醇-乙酸铵缓冲液^[2]作流动相，但出现保留时间不稳定或基线漂移的情况。本实验尝试改用乙腈-甲酸铵缓冲液，基线平稳，保留时间稳定，定量下限2μg/mL满足检测需求。

3.2 蛋白沉淀的优化 万古霉素是水溶性化合物，不适宜采用液液萃取法^[3]。多数文献采用乙腈^[2]或高氯酸溶液^[4]作为蛋白沉淀剂，但高氯酸属管制试剂，不易获取。本实验使用乙腈时绝对回收率仅14.89%~16.38%，将其中200μL乙腈替换为水，结果提高3.5倍，方法灵敏度亦得到提高。

综上，本方法操作简便，准确可靠。

参考文献

[1] 黄晓会, 林志燕, 沈艳琳, 等. 高效液相色谱法测定人脑脊液中万古霉素浓度及临床应用 [J]. 药学与临床研究, 2021, 29(01): 12-4.

[2] LIMA TM, SEBA KS, GONCALVES JCS, et al. A Rapid and Simple HPLC Method for Therapeutic Monitoring of Vancomycin [J]. J Chromatogr Sci, 2018, 56(2): 115-21.

[3] 谢春霞. 高效液相色谱法测定脑脊液中万古霉素的含量 [J]. 海峡药学, 2014, 26(11): 102-3.

[4] 孙秀漫, 朱协坤, 周楚娟, 等. 建立适用于联合用药多的患者万古霉素血药浓度监测的HPLC-DAD法 [J]. 今日药学, 2021, 31(02): 135-9.

作者简介：林盛，主管药师，E–mail：[e-mail]；佘玉奇，通信作者，E–mail：[e-mail]