分析IA-IIB肺腺癌的特异性生物标志物的检测技术原理

吴以勒

摘要：根据流行病学统计，肺癌患者数量占据癌疮首位，并且死亡率高。所以寻找癌症治疗方法迫在眉睫。在临床指南中，对于肺腺癌患者术后的治疗方案非常模糊。术后无法进行有效的精准评估，并且复发频率高难以预测。其根本原因是尚未发现患者的癌细胞特征驱动基因。因此追踪癌细胞的复制与进化产生的不同癌细胞的类群显得格外重要。本文重点相继从组织水平，蛋白水平，RNA水平，DNA水平上探讨特征化肺癌细胞进行分割化治疗。本文通过比较四种检测原理明确在DNA水平上进行基因突变检测能够客观的研究癌细胞的生物学机制，从而实现对IA-IIB肺腺癌进行分子分型。明确驱动基因和继发基因突变，为寻找药物提供有力保障。手术后，对循环血液中残留肿瘤DNA进行深度测序，一次判断患者身上的微小残留病灶的多少。以此来评估治疗疗效以及预测复发的可能性。通过比较四个水平上的检测原理，发现只有DNA水平上进行基因检测最有前景，可成为癌症精准医疗方法。

关键词：肺腺癌；检测技术原理；DNA突变；二代测序技术。

前言：根据流行病学统计，肺癌是最常见的实体瘤之一，每年有1.61百万的患者，有1.38百万的患者死于肺癌。肺癌没有感染力和其传播途径。对于其是否通过遗传方式传播也还是疑问。肺癌的首发大约是1-10年。复发期是0-5年。其致死率极高，占中国所有癌症死亡人数的27%。肺癌已成为目前医疗领域的主要负担，消耗大量的医疗资源。在我国的癌症病发率的统计中，有22.7%的癌症患者属于肺癌。所以对于肺癌的研究与治疗对于人类至关重要。

（一）组织学常用检测技术原理及应用：

石蜡切片技术：是组织学中最常见的制片方法之一，用于观察组织细胞的结构形态，以及研究组织细胞的形态变化。其主要步骤有：

1. 采用适当化学液固定细胞，并维持其活细胞形态。

2. 采用从低浓度到高浓度的无水乙醇处理样品，从而达到脱水的目标。

3. 使用媒浸液将组织内的酒精置换出。

4. 将组织样本放入熔化的石蜡中进行包埋。

5. 完成包埋后，用切片机对样本进行切片。

6. 将恒温水浴锅的温度设定在37C，展开切片，将展开的贴片放置在恒温箱内干燥大约两小时，恒温箱温度设置为60 C。

7. 使用二甲苯中对切片进行脱蜡处理。一次使用95%、85%、70%浓度的酒精对样品进行水化处理。整个过程大概需要耗时24 h。

苏木精伊红染色技术：是病理组织学切片中最广泛使用的一种染色方法。苏木精染色液体会与细胞核反应，将细胞核染色成深浅程度不一的蓝色。伊红染色液体会与蛋白质上的氨基结合，将细胞胞浆染色长程度不一的红色。蓝色与红色的细胞核形成鲜明对比，直观的观测到组织中细胞核的增值情况。苏木精伊红染色有以下几个步骤。

1. 将处理好的样品放入苏木素染色液中5-10分钟。

2. 将样品浸在自来水中，洗去多余的染色液。

3. 再用蒸馏水洗涤。

4. 根据不同分化液体的分化时间进行分化。

5. 用伊红染色样品，30s至2 mins的范围内。

6. 用70%乙醇洗涤2次，如需脱水、透明后封片按后续步骤进行，70%乙醇洗涤后仍可按照后续步骤进行脱水、透明和封片处理。根据染色情况知道细胞核与细胞质的比例，以此推测组织癌变情况。缺点是，只知道组织细胞形态，不知道癌细胞的具体位置。

（二）蛋白质表达量

肿瘤标识物是指在肿瘤的发生和增值过程中生成的特定物质。通过测量血清中肿瘤标识物的含量，可以有效的推断肿瘤在人体体内的发展情况。检测患者的肿瘤标识物的水平有助于早期诊断，以及评估治疗效果。其中CA19-9属于重要的肿瘤标识物。CA19-9的水平高低可以提醒手术难易程度，并且对术后的情况进行有效评估。CA19-9检测技术，虽然可以检测肿瘤增长的程度，并且确定癌细胞的特殊特征。但是无法检测基因层面。所以需要在更加细致的RNA层面上对癌症进行检测。

（三）FISH技术

技术原理如下：RNA荧光原位杂交技术可以确定特定RNA序列。其技术的主要步骤为：使组织切片进行逆转录生成DNA，使用核糖核酸酶H对mRNA进行降解。向互补DNA环境中加入大量探针，等待探针与DNA上的碱基充分反映。然后除去环境中的剩余探针，再向目标DNA加入特异性荧光基团，使其与不同探针进行配对。最后达到对DNA序列上的各种碱基可视化的目的。

（四）DNA突变与基因检测技术

在DNA层面上，所有的癌症都是由于基因的突变而产生的。本段落重点介绍单碱基突变。

4.1单碱基DNA突变的三种结果：单碱基突变指DNA序列中其中一个碱基发生了改变。其改变分为缺失或增添，到位或移位。单碱基突变会产生三种可能。第一种可能是同义突变。DNA碱基是由每三个碱基为一组成为一个密码子。由于人体的密码子有六十四对，而人体中所存在的氨基酸只有二十个。所有一些单碱基突变造成密码子的改变最终并不会影响其氨基酸的匹配。第二种可能是碱基替换可能是一种错义突变，即改变的密码子对应于不同的氨基酸。第三种可能是无意突变，其碱基突变的密码子对应停止信号。

4.2三种点突变： 第一种为缺失/增添，在基因序列上加入一个核苷酸对，或者从基因序列上减去一个核苷酸对。如果一个核苷酸对被加到这个序列上或从这个序列上减去一个核苷酸对，从那个点开始的阅读框将被一个核苷酸对移动，所有下游的密码子都将被改变。其结果会导致所生成的蛋白质由正常氨基酸序列和无功能意义的氨基酸序列两部分组成。移位会导致十分严重的功能丧失。第二种为转换突变，指一个嘧啶碱基取代另一个嘧啶碱基，或者是一个嘌呤碱基取代另一个嘌呤碱基。胞嘧啶和胸腺嘧啶是人体基因序列上的两种嘧啶碱基，腺嘌呤和鸟嘌呤是人体基因序列上的两种嘌呤碱基。转换突变的可能只存在在两种相同碱基的转换。第三种为逆转突变，一个嘌呤碱基取代一个嘧啶碱基。

4.3 一代测序：Sanger测序是利用电泳技术，对与DNA碱基进行分离并且排序。完成之后用X胶片光放射，显示各个碱基在核算片段中的位置。其具体步骤分为四步。单个目的基因序列。再利用PCR体外扩增技术，对目标DNA片段进行大量克隆。然后在待测样品中加入四种dNT以及ddNTP。对DNA序列进行电泳，再利用X胶片光放射得到目标DNA的具体序列信息。其优点为精准度高，测序时间短。缺点为对于大量DNA测序所需价格昂贵，并且每次测序的目标DNA只能一小段。

（五）现代常用的检测技术

5.1 实时定量PCR： PCR技术将少量基因序列进行体外扩增，利用琼脂电泳技术获取制定核算序列。PCR扩增技术使用DNA聚合酶，核苷酸和引物。将人工合成的DNA单链引物与模版DNA结合，以dNTP为底物。利用DNA聚合酶沿着模版双链进行合成新的DNA片段形成DNA的体外扩增。实验步骤为：第一步：配置反应：将缓冲剂，<0.4mM浓度的dNTPs，<0.4uM浓度的正向引物, <0.4mM浓度的反向引物, <100ng浓度的DNA样本，5U浓度的热启动酶，Up to 50 ul浓度的ddH2O加入到离心管中。使用热启动酶启动扩增反应。第二步：等待扩增结束后进行电泳鉴定。第三步：按照目标DNA片段大小制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，并加入电泳缓冲液。将液体加热到40摄氏度。将电泳缓冲液加入到电泳槽中。第四步：将样品加入到点样孔中。第五步：对电泳进行通电。第六步：关闭电源，根据DNA片段所处位置获取目标基因片段。PCR扩增技术，帮助临床诊断和分子生物学研究。

5.2 qPCR: PCR技术使得小量的DNA样品可以转化为大量的DNA样品。PCR技术通常被看作是其他技术的一个步骤而不是一个测序工具。qPCR在PCR的基础上增加了荧光染料和荧光剂。反应过程中需要热循环仪来检测荧光。荧光计在热循环器运行时实时检测荧光，在PCR扩增过程中给出读数。其反应过程称为逆转录聚合酶链反应。qPCR产生的读数提供了关于原始非逆转录样本中难以测量的mRNA数量的信息。qPCR运行产生的数据类型很大程度上取决于所使用的引物和染料。

5.3 二代测序技术（NGS技术原理及优势）：Sanger测序在近十年当中占主要的DNA测序方式，但是其目标片段小，无法微量化的局限性无法满足大范围精准的DNA测序。（1) 相比之下，二代测序技术在PCR的技术上，利用高性能的计算机进行大范围的测序。高通量测序打破了Sanger测序的局限性，可以检测10，000以上的碱基数量（2）这在生命科学领域上是极大的突破，也极大的促进了生命科学的发展。NGS测序的应用：血液循环系统中残留的肿瘤DNA检测。当病人经历手术成功切除肿瘤后，NGS帮助医生判断患者是否治愈，或者还是存在残留病灶。当DNA死亡，或者肿瘤死亡后。其会流入到血压当中。如果使用NGS技术检测到体内残留肿瘤释放出的突变DNA，说明身上有残留的病灶，治疗不完全。NGS测序技术帮助医生对临床患者的疗效进行评估。

参考文献：

Larsson, C., Grundberg, I., Söderberg, O., and Nilsson, M. (2010). In situ detection and genotypingof inpidual mRNA molecules. Nat. Methods 7, 395–397. doi: 10.1038/nmeth.1448

Niesters HG, Zoulim F, Pichoud C, et al. Validation of the INNOLiPA HBV DR assay (version 2) in monitoring hepatitis B virusinfected patients receiving nucleoside analog treatment. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54: 1283-1289.

Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol, 2008, 26: 1135-1145