羟丙甲纤维素细菌内毒素检测方法研究

张雅 李丹 赵莹 侯宁 　李敬

摘要　建立羟丙甲纤维素细菌内毒素检测方法。参考《中国药典》2020年版四部通则<1143>细菌内毒素检测方法中的凝胶法进行本次检测方法验证和结果判定^[1]。分别使用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生化工业有限公司两个厂家的鲎试剂进行本次研究。根据使用该辅料的混悬注射剂细菌内毒素限度和临床应用要求，确定羟丙甲纤维素的细菌内毒素限度为1.5EU·mg^-1。其最小有效稀释浓度为0.17mg·mL^-1，可用灵敏度为0.25EU·mL^-1的鲎试剂进行细菌内毒素检测。

关键词 羟丙甲纤维素；细菌内毒素；鲎试剂

羟丙甲纤维素 (hydroxypropyl methyl cellulose， HPMC) 是属于非离子型纤维素混合醚中的一个品种，是一种半合成的、不活跃的黏弹性聚合物^[2]，作为助悬剂广泛应用于混悬型注射剂和眼用制剂。《中国药典》2020年版四部中收录了羟丙甲纤维素，但是并没有对其细菌内毒素检测做出规定，目前国内尚无检测羟丙甲纤维素细菌内毒素的相关报道。鉴于其作为注射剂的药用辅料，为严格控制制剂的产品质量，本文参考《中国药典》2020年版四部通则<1143>建立了羟丙甲纤维素的细菌内毒素检测方法，为该辅料和混悬型注射剂的质量控制提供了依据。

1 材料

1.1试剂和样品 羟丙甲纤维素，批号201112,201113,201114，由辅料厂家提供；鲎试剂（①湛江安度斯生物有限公司，批号2007271，灵敏度0.25EU·mL^-1；②福州新北生化工业有限公司，批号19110912，灵敏度0.25EU·mL^-1）；细菌内毒素检查用水（BET），湛江安度斯生物有限公司，批号1911120；细菌内毒素工作标准品，湛江安度斯生物有限公司，批号1912102，规格10EU·支^-1；pH试纸；稀盐酸；碳酸氢钠。

1.2 仪器 ET-96内毒素凝胶法测定仪，天津市天大天发科技有限公司；Vortex-Genie2旋涡混合器，美国Scientific Industries公司。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验

根据鲎试剂灵敏度标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用BET溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制备成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取复溶后的规格为0.1ml/支的同一批号待复核鲎试剂18支（管），其中16支（管）分别加入0.1ml的浓度为2λ、λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行做4支（管）；另外2支（管）分别加入0.1ml细菌内毒素检查用水，作为阴性对照。按照排放次序将加样后的鲎试剂安瓿放入37℃±1℃内毒素凝胶法测定仪中，保温时间为60分钟±2分钟。两个厂家的鲎试剂依次进行灵敏度复核试验。所得试验结果如下，最大浓度2λ管均为阳性，λ管均为阳性，0.5λ管均为阴性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照均为阴性。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc＝lg^-1(∑X/4)。通过计算，λc（湛江安度斯生物有限公司）＝lg^-1((lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4)=0.25EU/ml；λc（福州新北生化工业有限公司）=lg^-1((lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4)＝0.25EU/ml。两个厂家鲎试剂λ_C均在0.125EU/ml～0.5EU/ml（0.5λ～2λ）之间。鲎试剂灵敏度复核试验均符合规定，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度0.25EU/ml为该批鲎试剂的灵敏度。

2.2干扰试验

2.2.1 最小有效稀释浓度的确定

以醋酸曲安奈德注射液（规格：5ml:50mg）为例，羟丙甲纤维素作为该制剂的助悬剂，药典中该制剂的细菌内毒素限值为：每1mg醋酸曲安奈德中含内毒素的量应小于3.0EU^[1]。为保证制剂的细菌内毒素满足标准，并严格控制辅料质量，将羟丙甲纤维素的细菌内毒素标准定为小于1.5EU·mg^-1。根据最小有效稀释浓度公式c=λ/L，λ为0.25EU·mL^-1，L=1.5EU·mg^-1，c=0.25EU·mL^-1/1.5EU·mg^-1=0.17mg·mL^-1，即本品的最小有效稀释浓度为0.17mg·mL^-1。

2.2.2 干扰试验

取3批样品，用BET水逐步稀释为浓度为0.34mg·mL^-1的供试品溶液，再稀释一倍即得浓度为0.17mg·mL^-1的供试品溶液（必要时用稀盐酸或碳酸氢钠调节pH值，使供试品溶液与鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0至8.0之间）。分别取浓度为4.0λ、2.0λ、1.0λ和0.5λ的内毒素标准液，与上述0.34mg·mL

^-1的供试品溶液等体积混合均匀，即得含4λ(1.0EU/ml)、2λ(0.5EU/ml)、λ(0.25EU/ml)、0.5λ(0.125EU/ml)和0.25λ(0.0625EU/ml)内毒素浓度的供试品阳性对照溶液。取细菌内毒素工作标准品，用BET溶解，在旋涡混合器上振荡15分钟后逐级稀释到4λ(1.0EU/ml)、2λ(0.5EU/ml)、λ(0.25EU/ml)、0.5λ(0.125EU/ml)和0.25λ(0.0625EU/ml)的标准溶液作为阳性对照组。将供试品组、供试品阳性对照组、阴性对照组和阳性对照组进行干扰试验。试验结果显示，供试品溶液组和阴性对照组的所有平行管都为阴性，并且两个阳性组的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求。即Es、Et均在0.125EU/ml～0.5EU/ml（0.5λ～2λ）之间，鲎试剂干扰试验结果无显著差异，说明供试品在该浓度下无干扰作用。

2.3 供试品检查方法验证

取3批样品，用BET水逐步稀释为浓度为0.17mg·mL^-1（必要时用稀盐酸或碳酸氢钠调节pH值，使供试品溶液与鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0至8.0之间）作为供试品溶液。使用灵敏度为0.25EU·mL^-1的两个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查。试验结果显示阴性对照溶液平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液平行管均为阳性，阳性对照溶液平行管均为阳性，供试品组均为阴性，结果符合规定。

3 结论

根据使用该辅料的混悬注射剂细菌内毒素限度和临床应用要求，确定羟丙甲纤维素的细菌内毒素限度为1.5EU·mg^-1。其最小有效稀释浓度为0.17mg·mL^-1，可用灵敏度为0.25EU·mL^-1的鲎试剂进行细菌内毒素检测。为有效控制使用该辅料的注射剂细菌内毒素满足要求提供了依据。

参考文献

1. 国家药典委员会编．中华人民共和国药典[S]．2020年版．中国医药科技出版社．2020：29．

2. 宫艳畅，杨白雪，孙瑞濛等．羟丙甲纤维素的来源差异对其性质及功能性的影响[J]．中国医药工业杂志，2020 ，51(9)．