亮氨酸在微生物限度检查方面的研究

吴岳虹 焦爽

摘要：我公司现依据《中国药典》2015版收载的微生物限度检查法对亮氨酸进行微生物限度检查，进行实验以保证检测方式符合要求。确保该方式在本实验室现有实验条件下具有良好的适用性、稳定性及准确性，能够确实有效的控制与保障产品质量。

关键词：检查方式的研究、控制与保障产品质量

引言：根据要求，需对亮氨酸微生物限度检查方式进行研究。研究内容包括需氧菌数量、霉菌和酵母菌数量和控制菌大肠埃希菌方法的研究。按照亮氨酸的理化特性与生物学特性，制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行亮氨酸微生物限度检查；若不符合，应重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准，以确定适合的检查方法，提高效率的同时也要保障产品的质量。

1. 仪器与材料：

1.1仪器与材料

试验用供试品：选取三批亮氨酸。

1.2验证用设备：

表1：试验用设备及耗材一览表

仪器设备名称	型号（设备编号）	生产厂家
生物安全柜	BSC-1100 II A2-X（023030350）	BIOBASE
生化培养箱	BIR-250B（0220603154）	SANTN
生化培养箱	BIR-250B（0220603144）	SANTN
生化培养箱	BIR-250B（0220603155）	SANTN
电子天平	BSA822	Sartorius

1.3试验用玻璃器具、仪器：验证中所用计量器具均须经计量部门的校验，合格后，才能使用。

1.4验证用培养基及缓冲液：验证中所用的培养基均须经过适用性试验，培养基和试液均须经过121℃灭菌15分钟，并且应保证在验证使用过程中都在灭菌的效期之内，如超出之后不再使用。

1.5试验用培养基及缓冲液：

表2：试验用培养基及缓冲溶液一览表

培养基及缓冲液名称	配制灭菌日期	失效日期
胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）	TSA20190909	2019.09.29
沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）	SDA20190909	2019.09.29
沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）	SDB20190909	2019.09.29
胰酪大豆胨液体培养基(TSB)	TSB20190909	2019.09.29
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(SCB)	SCB20190909	2019.09.29
麦康凯琼脂培养基（MacA）	MacA20190909	2019.09.29
麦康凯液体培养基（MacB）	MacB20190909	2019.09.29
含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（3SCB）	3SCB20190909	2019.09.29

1.6试验用菌种：

表3：验证菌种一览表

菌种名称	菌种代码	来源	代次
金黄色葡萄球菌	CMCC（B）26003	中国食品药品检定研究院	3
铜绿假单胞菌	CMCC（B）10104	中国食品药品检定研究院	3
枯草芽孢杆菌	CMCC（B）63501	中国食品药品检定研究院	3
白色念珠菌	CMCC（F）98001	中国食品药品检定研究院	3
黑曲霉	CMCC（F）98003	中国食品药品检定研究院	3
大肠埃希菌	CMCC（B）44102	中国食品药品检定研究院	3

铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为需氧菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株；大肠埃希菌为控制菌验证用菌株。

验证实验所用的菌株传代次数在5代以内（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），在保藏方式上采取适宜的方法，以保证试验菌株的生物学特性。

2.试验方法及结果

2.1 供试液制备：

2.1.1供试品：亮氨酸

2.1.2稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液

2.1.3制备方法：称取供试品10g，置于250mL锥形瓶中，加入稀释剂至100mL，混匀, 制作1:10的供试液。

2.2需氧菌、黑霉和酵母菌计数方式验证：

2.2.1试验组：吸取1:10供试液10ml至25ml试管中，加入0.1ml菌液（不大于10000cfu/ml），将试管中的液体摇匀后从中吸取1ml供试液倒入平皿中，将培养基立刻倒入平皿中，每株试验菌制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

2.2.2菌液组：吸取pH7.0无菌氯化钠－卵白胨缓冲液10ml至25ml试管中，加入0.1ml菌液（不大于10000cfu/ml），将试管中的液体摇匀后从中吸取1ml供试液倒入平皿中，将培养基立刻倒入平皿中，每株试验菌制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

2.2.3供试品对照组：吸取1:10供试液10ml至25ml试管中，加入0.1mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液，将试管中的液体摇匀后从中吸取1ml供试液倒入平皿中，将培养基立刻倒入平皿中，每株试验菌制备2个平皿，，按平皿法测定其菌落数。

2.2.4培养与计数：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑霉菌采用胰酪大豆胨琼脂培养基于30～35℃培养，白色念珠菌和黑曲霉菌采用沙氏葡萄糖琼脂培养基于20～25℃进行培养。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养不超过3天，白色念珠菌、黑霉菌培养不超过5天，观察菌落生长情况，培养繁殖结束后点计菌落数并报告。

2.2.5验证公式：

试验组的比值=

2.2.6结果判断：

完成三次独立的平行实验后，计算每一次验证试验的结果，即试验组的比率的结果，应在0.5～2.0范围内。若实验组的比率均在此范围内，则平皿计数方法验证可行。

若任一次试验中任一实验菌株试验组比值不在0.5～2.0范围内，先按照从操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件等方面逐一查找原因，然后按照《偏差管理SMP》进行分析，如为操作者、设备、物料、操作方法、环境条件等因素，应重新进行试验，如非上述因素造成比值不在0.5～2.0范畴内，则表明供试品在此检验条件下不适用，应与方法提供单位联系，进行新的方法研究。

2.3数据汇总

表6：需氧菌结果汇总表

需氧菌总和计数方法验证结果汇总
菌种名称	试验号	试验组 （cfu）	菌液组（cfu）	供试品对照组 （cfu）	比值
金黄色葡萄球菌	1	71	78	0	0.9
	2	72	78	0	0.9
	3	73	75	0	1.0
铜绿假单胞菌	1	72	74	0	1.0
	2	75	79	0	0.9
	3	76	82	0	0.9
枯草芽孢杆菌	1	73	79	0	0.9
	2	80	79	0	1.0
	3	75	79	0	0.9
白色念珠菌	1	42	46	0	0.9
	2	43	44	0	1.0
	3	41	45	0	0.9
黑曲霉	1	51	52	0	1.0
	2	48	50	0	1.0
	3	46	49	0	0.9

表7：黑霉和酵母菌总数及控制菌大肠埃希菌结果汇总表

黑霉和酵母菌总数计数方法试验结果汇总
菌种名称	试验号	试验组 （cfu）	菌液组（cfu）	供试品对照组 （cfu）	比值
白色念珠菌	1	44	47	0	0.9
	2	47	51	0	0.9
	3	40	44	0	0.9
黑曲霉	1	53	56	0	0.9
	2	49	50	0	1.0
	3	42	46	0	0.9

2.3控制菌验证：（大肠埃希菌）

在验证计数方式并且还应该验证控制菌检查的方式，以确保所采用的验证方式适合于该药品在控制菌方面的检查。

2.3.1试验组：取1:10供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌，注入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀,于30℃～35℃培养箱中增菌培养18～24小时，备用。

2.3.2样品组：取1:10供试液10ml，注入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，于30℃～35℃培养箱中增菌培养18～24小时，备用。

2.3.3阴性对照组：取10mlpH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液，注入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，于30℃～35℃培养箱中增菌培养18～24小时，备用。

2.3.4阳性对照组：取不大于100cfu大肠埃希菌，注入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，于30℃～35℃培养箱中增菌培养18～24小时，备用。

2.3.5分别取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。

2.3.6分别取麦康凯液体培养物涂抹接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。观察培养后的平板，若平板无菌落生长或有菌落生长但菌落形态不符合大肠埃希菌的菌落形态特征，可判为未检出大肠埃希菌。若平板有菌落生长且菌落形态符合大肠埃希菌的菌落形态特征，可判为检出大肠埃希菌。

表8：控制菌大肠埃希菌结果汇总表

控制菌大肠埃希菌方法验证结果汇总
试验号	试验组	样品组	阴性对照组	阳性对照组
1	+	-	-	+
2	+	-	-	+
3	+	-	-	+

3小结：

在实验的结果中，如果阴性对照组和样品组应没有检出实验菌，阳性对照组检出实验菌。若实验组检出试验菌，则可按照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌检查；若实验组未检出试验菌，先按照从操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件等方面逐一查找原因，然后按照偏差处理程序进行偏差分析，如为操作者、机械设备、物料、操作方法、环境条件、检测等因素，处理后应重新进行验证试验，如非上述因素造成试验组未检出试验菌，则表明供试品在此检验条件下不适用，应与方法提供单位联系，进行新的方法研究。

参考文献：

1. 吕文博，解艳，《学术期刊》1P25-P25 R19 R9

2. 郑兆银，陈延晶，《学术期刊》R927.11P1-P3.2015.8

[3] 姚卫红 张丽娜 刘美秀,P516—P516 R92 R9 《健康必读（下旬刊）》