恒温扩增技术在分子诊断中的应用

刘婷

摘要：既往临床诊断中主要对聚合酶链反应（PCR）技术进行应用，但其存在一定程度的缺陷，而恒温扩增技术因为具有引物种类的多样性，所以检测方法相对多变，能够对传统PCR中存在的缺陷有效弥补，并在分子诊断工作中得到了广泛应用。

关键词：恒温扩增技术；分子诊断；应用

相对于常规PCR技术，对恒温扩增技术进行应用，其不仅不需要应用专门的仪器，且更加的快速和高效。当前广泛应用的恒温扩增技术主要包括依赖核酸序列扩增（NASBA）、转录介导扩增（TMA）、环介导等温扩增（LAMP）等多种形式，其各具优缺点，且能够在分子诊断工作之中起到不同的作用。

一、依赖核酸序列扩增（NASBA）

NASBA是主要适合应用于RNA的扩增之中，针对体外特异、连续均一且引物介导的单链RNA实施恒温扩增，需要于42℃的环境中使用两个小时左右的时间，将模板RNA扩增至其10⁹——10¹²倍。对NASBA进行应用：（1）在NASBA电化学发光技术检测法方面，需要对电化学发光技术原理进行应用，针对RNA产物实施检测工作，完成扩增反应以后，使用经过生物素标记的探针与RNA产物结合形成复合物，并由寡核苷酸饱和磁珠携带至电极处，受到低电压影响，钌离子能够出现氧化还原反应并产生光子，并于三丙胺作用下再生，可见电极处的RNA产物与光信号强度具有密切关联性，二者呈正相关关系，所以可以通过电化学发光检测技术对620nm位置的发光强度进行检测并明确RNA定量；（2）核酸杂交检测法的应用，将NASBA为基础结合原位杂交技术形成原位NASBA，使用原位杂交技术探针及RNA扩增产物进行杂交，再使用紫外分光光度计对探针量进行监测，可以实现RNA产物的定量分析工作^[1]。

二、环介导等温扩增（LAMP）

LAMP属于一项新型的核酸扩增技术，其具有扩增效率较高的特点，其扩增效率最高能够达到普通PCR的100倍左右，同时特异性较强，并且所需的反应时间较短，一般30——60min即能够实现一次扩增反应，在临床样本量大时，可以实现快速的检测，另外，对LAMP进行应用的成本相对较低，仅需恒温器即可。对LAMP应用的基础在于，DNA于65℃左右的环境中属于动态平衡的状态，在引物和双链DNA互补区域开展碱基配对延伸时，另一条链即能够进行解离并转化成为单链。当前LAMP主要应用于细菌、病毒、支原体、寄生虫的检测工作当中，可以对甲型流感病毒分型、单纯疱疹病毒、1型丙型病毒性肝炎基因等进行检测^[2]。

三、连接酶链反应（LCR）

耐热DNA连接酶能够于不同温度环境之中保持活性的恒定，即使经过数次热循环，依然能够保持良好的活性，所以其反应体系可自动扩增，并促使反应产物的指数成倍数增长。在温度不断循环的情况下，连接酶链反应也能够不断重复进行，从而使DNA的扩增得以实现。相对于PCR，对LCR进行应用更加便捷和高效。耐热连接酶检测工作仅需两个温度循环即可：（1）94℃环境下变性1min；（2）65℃环境下4min负性连接。并且，相对于其他各项恒温扩增技术，LCR能够更加明确的对寡聚核苷酸是否与模板DNA互补进行充分明确，可以对点突变进行检测，在临床上则主要应用于对微生物、病原体进行检测^[3]。

四、转录介导扩增（TMA）

通过对RNA聚合酶以及反转录酶进行应用，在42℃左右的等温反应条件之下，可以实现核糖体RNA的扩增，15——30min之间即能够将把序列扩增至原有的约10¹⁰倍。对TMA进行应用，其具有操作简捷和扩散效率较高的特点。当前已有企业投入对TMA相关产品及诊断器械的研发工作之中，有望实现TMA的自动化操作，以大幅度降低由人工操作所导致的污染和可能存在的误差，并可以更加有效的将TMA应用于临床上的大量筛查工作之中。当前TMA已经能够应用于细菌检测、病毒检测、人类白细胞抗原等位基因分型等工作之中，在沙眼衣原体检测、乙肝病毒检测、丙肝病毒检测、艾滋病病毒检测工作中均得到了广泛的应用，若能够实现TMA的自动化，其则能够在医疗诊断领域发挥更大的作用^[4]。

五、链替代扩增（SDA）

SDA具有扩增效率较高的特点,使用SDA对结核分枝杆菌总DNA部分序列进行处理，在37℃环境下，两小时之后，靶序列即能够得到10⁶倍的扩增，并且特异性强，且反应时间短，不需对具有特殊性的仪器设备进行应用。但是，SDA存在产物不均一的情况，若对电泳进行应用，可能存在产物拖尾现象，并且不能够直接进行克隆、测序、表达，所以当前并未广泛的应用于临床之中，而是主要在分枝杆菌核酸的定性检测工作中发挥作用^[5]。

结束语：

在本文中，主要针对5种恒温扩增技术在分子诊断中的应用进行了简要分析，因为其各具不同的使用原理，且所需的引物及检测方式各不相同，所以其能够应用于不同的领域之中，当前主要应用于病毒、细菌、支原体、寄生虫的检测之中，以及基因扩增、核酸测序等分析之中。因为从总体上来看，恒温扩增技术具有显著的高效、快速优势，而且不需要对特殊仪器进行应用，同时还能够对传统PCR所存在的缺陷进行有效弥补，所以当前恒温扩增技术已经能够在越来越多的分子诊断中得到良好应用，并起到越来越显著的应用效果。

参考文献：

[1]韩建冬,王红康,王建民, 等.分子病理学在诊断学中的应用与研究[J].亚洲心脑血管病例研究,2019,7(01):8-15.

[2]李辉.恒温扩增技术在结核病诊断中的应用[J].结核病与肺部健康杂志,2017,6(2):102-105.

[3]宋红焕,邵燕,李燕, 等.两种分子诊断技术对提高结核病病原学检测阳性率的评价研究[J].结核病与肺部健康杂志,2019,8(3):168-171.

[4]王林,姜明月,秦宇, 等.人乳头状瘤病毒DNA恒温扩增技术在宫颈癌筛查中的应用价值[J].中华肿瘤杂志,2018,40(4):313-318.

[5]王林,姜明月,曹雪芳, 等.恒温扩增HPV检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究[J].病毒学报,2018,34(4):498-504.