基于网络药理学探讨二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的作用机制

范敏 1， 郑文兰 2

摘要：目的：基于网络药理学探讨二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的可能作用机制。方法：运用TCMSP平台对二至丸中活性成分及潜在作用靶点进行预测并筛选；检索GeneCards数据库获取无排卵性异常子宫出血相关靶点，利用Cytoscape软件构建活性成分-靶点相互作用网络；利用DAVID对核心靶点进行KEGG相关通路富集分析。结果：二至丸的活性成分有槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等12个，核心靶标基因有CASP8、CASP9等6个；KEGG结果提示，二至丸活性成分发挥治疗作用与细胞凋亡等信号通路相关。结论：二至丸活性成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等可能通过调节CASP8、CASP9等关键核心靶点来调控细胞凋亡等信号通路而达到治疗无排卵性异常子宫出血的目的。

关键词：网络药理学；二至丸；无排卵性异常子宫出血

无排卵性异常子宫出血属于中医“崩漏”范畴，是月经周期、经期、经量发生严重失常的病证，由于下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调引起的异常子宫出血。二至丸由女贞子、墨旱莲按1:1比例配伍而成，中医古籍《兰室秘藏·妇人门· 经漏不止》: “妇人血崩，是肾水阴虚，不能镇守包络相火，故血走而崩也。”指出肾阴耗损，阴虚阳搏是崩漏的重要病机^[1]，故辨证治疗在于补肝肾之阴、固冲任止血。临床上二至丸治疗肾阴虚型崩漏疗效显著，但目前对其效应机制研究尚少，中药通过多种活性成分、多个靶点及多条途径调控疾病的机理仍不清楚，本文借助网络药理学技术探究二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的可能分子机制，为实验研究提供理论基础。

网络药理学是一种运用高通量的方式从中药中筛选化合物，预测药物在分子水平上的药理作用，从系统的角度和分子水平上揭示网络调控效应的新兴技术，改变了传统的“一靶、一药、一病”模式，注重“多组分、多靶点”相互作用，符合中医整体、系统的理念^[2]。本文利用数据库归纳二至丸活性成分、核心靶点与信号通路间的关联性及相互作用，分析二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的可能作用机制。

1.资料与方法

1.1 二至丸活性成分的筛选与靶点预测

运用中药系统药理学分析平台（TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php），输入关键词女贞子、墨旱莲，检索出所含化学成分。设置口服生物利用度OB≥30％及类药性DL≥0.18筛选活性成分，保证获取的化学成分具有较高活性。再利用数据库检索二至丸活性成分相关的靶点。

1.2 无排卵性异常子宫出血的靶点获取及活性成分-核心靶点网络的构建

运用GeneCards数据库搜索无排卵性异常子宫出血的相关靶点，利用Venny工具将二至丸活性成分靶点与疾病靶点进行比对得出核心靶点，使用Cytoscape软件构建活性成分-核心靶点网络图，作可视化处理。

1.3 KEGG靶点-通路分析

将上述获取的二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的作用靶点导入DAVID数据库，进行KEGG通路富集分析。

2.结果

2.1 二至丸活性化合物的筛选 通过检索TCMSP数据库共收集到二至丸中总化合物167个，女贞子119个，墨旱莲48个，再设置 OB≥30%和DL≥0.18的筛选条件得到23个活性成分较高的化合物，女贞子13个，墨旱莲10个，剔除重复化合物2个共21个。（见表1）

表1 二至丸21个化合物信息表

Mol ID	Molecule Name	OB/％	DL	来源
MOL000358	beta-sitosterol	36.91	0.75	女贞子
MOL000422	kaempferol	41.88	0.24	女贞子
MOL004576	taxifolin	57.84	0.27	女贞子
MOL005146	Lucidumoside D	48.87	0.71	女贞子
MOL005147	Lucidumoside D_qt	54.41	0.47	女贞子
MOL005169	(20S)-24-ene-3β,20-diol-3-acetate	40.23	0.82	女贞子
MOL005190	eriodictyol	71.79	0.24	女贞子
MOL005195	syringaresinol diglucoside_qt	83.12	0.8	女贞子
MOL005209	Lucidusculine	30.11	0.75	女贞子
MOL005211	Olitoriside	65.45	0.23	女贞子
MOL005212	Olitoriside_qt	103.23	0.78	女贞子
MOL000006	luteolin	36.16	0.25	女贞子/墨旱莲
MOL000098	quercetin	46.43	0.28	女贞子/墨旱莲
MOL001790	Linarin	39.84	0.71	墨旱莲
MOL001689	acacetin	34.97	0.24	墨旱莲
MOL002975	butin	69.94	0.21	墨旱莲
MOL003378	1,3,8,9-tetrahydroxybenzofurano[3,2-c]chromen-6-one	33.94	0.43	墨旱莲
MOL003389	3'-O-Methylorobol	57.41	0.27	墨旱莲
MOL003398	Pratensein	39.06	0.28	墨旱莲
MOL003402	demethylwedelolactone	72.13	0.43	墨旱莲
MOL003404	wedelolactone	49.6	0.48	墨旱莲

2.2 二至丸活性成分靶点的预测 二至丸方中候选化合物21个,检索Uniprot数据库得出315个潜在作用靶点,其中女贞子172个,墨旱莲143个,剔除重复潜在作用靶点共102个。

2.3 活性成分靶点与无排卵性异常子宫出血靶点的预测 通过检索GeneCards数据库，得出无排卵性异常子宫出血潜在作用靶点36个，将二至丸中化合物靶点与无排卵性异常子宫出血靶点进行匹配，得出二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的作用靶点6个，分别是脂肪酸合成酶（FASN）、胰岛素样生长因子II（IGF2）、雌激素受体1（ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（CASP8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（CASP9）、前列腺素氧化环化酶1（PTGS1）。以Venn图体现交集靶点。（见图1）

图1 二至丸活性靶点与无排卵性异常子宫出血靶点关系Venn图

2.4 二至丸与无排卵性异常子宫出血分子靶点网络构建 运用Cytoscape3.7.1构建成分-靶点网络图，将获得信息进行可视化处理。图中共包括20个节点（红色代表药物，紫色代表疾病，蓝色代表活性成分，绿色代表核心靶点），62条边，每条边表示相互作用关系。结果显示与核心靶点关联的成分有12个，分别是槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、圣草酚（eriodictyol）、花旗松素（taxifolin）、Lucidumoside D_qt、山柰酚（kaempferol）、紫铆素（butin）、3'-O-甲基香豌豆苷元（3'-O-Methylorobol）、红车轴草素(Pratensein)、金合欢素（acacetin）、蟛蜞菊内酯（wedelolactone），二至丸中有效活性成分广泛作用于核心靶点，体现了多成分、多靶点共同调控疾病的特点。（见图2）

图2 二至丸活性成分与无排卵性异常子宫出血核心靶点互作网络图

2.5 KEGG靶点-通路分析 运用DAVID数据库对二至丸作用靶点进行KEGG通路富集分析，得出7条通路，富集的通路中涉及细胞凋亡（Apoptosis）、病毒性心肌炎（Viral myocarditis）、军团菌病（Legionellosis）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）、弓形虫病（Toxoplasmosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）等，说明这些通路除了治疗无排卵性异常子宫出血外，也可能被调控发挥治疗其他相关疾病的作用。在相关基因中，CASP8、CASP9富集于所获取的通路上，提示二至丸活性成分治疗无排卵性异常子宫出血可能通过调节凋亡基因的表达来实现。（见表2）

表2 二至丸治疗无排卵性异常子宫出血潜在靶点的KEGG通路富集分析

名称	P值	相关基因
细胞凋亡	0.044	CASP8、CASP9
病毒性心肌炎	0.046	CASP8、CASP9
军团菌病	0.048	CASP8、CASP9
p53信号通路	0.051	CASP8、CASP9
甲状腺激素信号通路	0.073	CASP9、ESR1
弓形虫病	0.081	CASP8、CASP9
乙型肝炎	0.095	CASP8、CASP9

3.讨论

本研究利用网络药理学筛选出二至丸活性成分、核心靶点及信号通路，探讨二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的分子机制。得出二至丸主要活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、红车轴草素、金合欢素等有效成分，现代药理研究显示槲皮素、山柰酚具有抑制血小板的聚集，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用^[3-4]；β-谷甾醇、金合欢素、红车轴草素具有抗细胞增殖、诱导凋亡及改变细胞周期的作用，且金合欢素还可上调p53蛋白的表达，抑制癌细胞增殖的作用^[5-7]。研究表明二至丸能够改善机体血液流变学及子宫内膜的微循环，防止内膜缺血坏死，促使子宫内膜由增生期转变为分泌期

^[8]，与上述活性成分的药理报道结果相一致。

通过活性成分靶点与疾病靶点交集映射获得CASP8、CASP9等核心靶点，且通过KEGG富集分析结果显示，二至丸有效成分发挥治疗效应可能与细胞凋亡通路关系密切。细胞凋亡是多基因及通路联合调控的细胞程序性死亡方式，对维持细胞正常功能具有重要作用。CASP8、CASP9靶标富集于所获的7条通路上，表明二至丸活性成分可能的作用机制是调节细胞凋亡与增殖的关系、改变细胞周期，促使子宫内膜的生长、转化时间符合月经周期的规律性变化，进而达到治疗无排卵性异常子宫出血的作用。

综上，二至丸活性成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等可能通过细胞凋亡等信号通路作用于CASP8、CASP9等核心靶点发挥治疗无排卵性异常子宫出血的作用。体现了中药多种成分-多个靶点-多条通路调控疾病的作用机制，为后续研究二至丸治疗无排卵性异常子宫出血的机制奠定理论基础。

参考文献

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