青霉素 V分析方法及相关物质研究进展

冯薇 张小双 宋海英

摘要：对青霉素V钾分析方法进行了分析，并对青霉素V钾相关物质的研究进行了描述。指出有效控制生产工艺条件，减少青霉素V钾的降解，研发β-内酰胺环更稳定的抗生素, 或应用利于β-内酰胺环稳定的环境有效控制青霉素类抗生素高分子聚合物可能成为本领域研究的新热点。

关键词：青霉素V钾、相关物质、高效液相色谱

中图分类号：R978.1

青霉素V钾又名苯氧甲基青霉素钾，属于β-内酞胺类抗生素，多用于青霉素敏感菌株所致的轻、中度感染，也可用于螺旋体感染和作为风湿热复发和感染性心内膜炎的预防用药。青霉素V钾原料及制剂中可能会含有其合成前体、工艺副产物以及各种降解产物。另外，青霉素V钾也可能自身聚合，产生高分子聚合物。聚合物既可能来自生产过程，又可在储存或用药过程中形成。β-内酞胺类抗生素所致的过敏反应，经多年来的研究已经证明和药物中存在的高分子聚合物有关。

1、青霉素V钾分析方法

青霉素V的方法主要由容量分析法、紫外分光光度法、高效液相色谱法^[1]。

碘量法广泛应用于青霉素V生产中间过程的定量检测，但检测结果易受试验条件和分解产物的影响。同电位滴定法一样具有操作步骤烦琐的缺点。

高效液相色谱法是近年来发展很快的样品分离分析技术，具有快速、高效、灵敏、特异性强及重现性好等特点，受到各国药典的重视。美国药典采用此法测定青霉素V和青霉素V钾的含量，要求色谱柱效按青霉素V计不低于1800理论板数，青霉素G与青霉素V的分离度大于3.0。祝波^[2]等分别采用了不同流动相和梯度洗脱方式，使青霉素V和许多结构与性质相似的副产物或杂质得到很好分离。

中国药典2 0 15年版( C h P 2 0 15 ) 中除控制青霉素V钾原料总杂与最大单杂外, 还控制青霉素V聚合物；而国外BP标准中除控制青霉素V钾原料总杂，还控制各已知杂质及未知任意其他杂质。而且C h P 2 0 15 中青霉素V 钾有关物质检查方法与国外药典及文献报道方法在流动相、检测波长等方面均有较大差异。

2、青霉素V钾相关物质的研究

王芬卿^[3]等对青霉素V提取工艺进行了研究，指出影响青霉素V成品质量的杂质。在提取过程中，一些影响青霉素V提取的杂质如果不彻底去除，就会一直带入青霉素V成品中，这些杂质一般包括：苯氧乙酸，青霉素V噻唑酸，青霉素V脱羧噻唑酸，4-羟基青霉素V等。其中青霉素V噻唑酸，青霉素V脱羧噻唑酸是在发酵和提取过程中由青霉素V在中性或碱性条件下降解而形成的。苯氧乙酸是青霉素V发酵的前体物质，由于苯氧乙酸在青霉素发酵生物合成过程中，不属于优先被利用的前体，因此苯氧乙酸在发酵液中的浓度需要维持得比较高，所以在发酵液中有 1%-3%（g/ml）的苯氧乙酸存在，经过多次提取后，仍有少量残留到成品中。

1998 年有罗马尼亚学者连续发表一系列报道，用液膜分离青霉素V与苯氧乙酸，并且建立了数学模型。但考虑到青霉素V是个老品种，售价低廉，此技术应用起来比较昂贵，操作复杂，用于酶解生产半合成中间体有一定可能性，不太适合当前发酵液中分离青霉素V

的现状。

4-羟基青霉素V是青霉素 V成品中的另一个重要杂质，它是前体苯氧乙酸被菌丝氧化为4-羟基苯氧乙酸以后，结合到青霉素母核上形成的分子，在苯环对位它比青霉素V分子多一个氧原子。据报道，4-羟基苯氧乙酸比苯氧乙酸优先与母核结合。L.T.Chang等^[4]研究了4-羟基青霉素V的生成动力学，发现大部分4-羟基青霉素V是在发酵周期的后期产生的，当前体苯氧乙酸浓度低时，4-羟基苯氧乙酸和苯氧乙酸合成青霉素分子的效率一样。年轻的菌丝对前体氧化能力弱，仅用它构成青霉素V分子，随着菌龄的增大，氧化能力渐渐增加，因此在青霉素V发酵过程中，待放批号得到的滤液中，4-羟基青霉素V含量较少，但前体苯氧乙酸较多；而发酵终点的大罐批号，4-羟基青霉素V含量较多，但前体苯氧乙酸相对减少。由于4-羟基苯氧乙酸在发酵液中一般占3%-10%左右，其性质与青霉素V极其类似，很难除去，因此在多次提纯以后，仍有部分残留到成品中。

在青霉素研究的早期，人们就很重视4-羟基青霉素V的研究，1957年就有从青霉素V发酵液中提取4-羟基青霉素V的报道，操作如下：将青霉素V粗钾盐溶解到水中，调pH到2将青霉素V滤掉，母液依次用乙酸丁酯和pH6.5的磷酸缓冲液萃取，冷却，除去结晶析出的苯氧乙酸钠，在pH2用苯萃取。分离苯层后，中和到pH6.9，对水层酸化，形成油状沉淀。用乙酸丁酯在pH2萃取，加入以丁醇溶解的醋酸钾，过滤，用丁醇和水洗涤，就产生了一个苯氧乙酸钾盐和4-羟基青霉素V 钾盐的混合物，前者通过丙酮沉淀除去，在母液中加入更多丙酮，形成结晶性沉淀，除去丙酮，加入丁醇，真空浓缩，即生成第二组分。两种组分溶于含水丁醇，除水重结晶，碳处理后，进一步在丙酮中重结晶，熔点151～159℃（降解）。

此外，在青霉素V发酵液还存在有色物质和高分子杂质，用活性炭脱色和洗涤都可以将其部分或全部除去。高分子杂质是青霉素类抗生素的过敏原之一。通过青霉素分子的自身聚合而形成的聚合度各异的一类高分子物质。张兴艳^[5]等对青霉素类抗生素高分子聚合物的形成及影响因素进行了研究，研究表明影响青霉素聚合速度的主要因素有溶液酸碱度、固体含水量、环境温度、包装材料的密闭程度等，还指出从聚合反应方式来看，β-内酰胺环开环是聚合反应的结构基础。

3.结语

青霉素V钾作为一种重要的抗生素原料药及医药前体，在口服制剂和合成青霉素、头孢类的生产中广泛应用，开发快速、高效的分析方法是质量控制的保障，相关物质、高分子杂质的有效控制是质量控制的关键。因此，有效控制生产工艺条件，减少青霉素V钾的降解，研发β-内酰胺环更稳定的抗生素, 或应用利于β-内酰胺环稳定的环境有效控制青霉素类抗生素高分子聚合物可能成为本领域研究的新热点。

参考文献：

[1] 王明娟，王晨，王立新等. 青霉素V 钾及其有关物质分析方法的比较[J].药物分析杂质，2008,28（9）：1515~1520.

[2] 祝波，裴琳，仲娜等.HPLC法测定青霉素V钾片的含量[J].山东医药工业, 2002, 21(1):15~16.

[3 ] 王芬卿，青霉素V提取新工艺研究[D] ,天津大学，2007.

[4] L.T.Chang , E.L,Mc Grory, R.P. Elander, and D.J.Hook. Decreased production of para-hydroxypenicillin V in penicillin V fermentations[J]. Journal of Industrial Microbiology, 1991,7:175~180.

[5] 张兴艳，王霆，李苌清.青霉素类抗生素高分子聚合物的研究进展[J]. 中南药学,2011,9 (7 ):520-524.