卵巢上皮性肿瘤 DNA倍体分析与 P53表达的关系

芦嘉

【摘　要】目的: 分析卵巢上皮性肿瘤(EOT)患者的DNA含量，并研究其与P53蛋白表达的关系，为临床治疗提供指导。方法:选择在2012年10月到2015年10月间来我院进行治疗的140例卵巢上皮性肿瘤患者作为研究对象，采用流式细胞术对其石蜡包埋组织进行肿瘤单细胞DNA倍体分析；同时用免疫组化检测Ｐ53蛋白表达。结果: 交界性卵巢上皮性肿瘤与良性卵巢上皮性肿瘤相比较AT及P53阳性率均P<0.01,差异有统计学意义；交界性浆液性卵巢上皮性肿瘤与交界性黏液性卵巢上皮性肿瘤相比较AT阳性率P<0.05,差异有统计学意义；P53蛋白阳性率P<0.01，差异有统计学意义；癌性卵巢上皮性肿瘤与良性卵巢上皮性肿瘤及交界性卵巢上皮性肿瘤三者相比较AT及P53蛋白阳性率均为P<0.01，差异有统计学意义。结论: P53阳性表达与DNA异常有密切相关的关系,可能是因为抑癌基因蛋白失去活性,对DNA异变细胞失去修复排除功能,最终导致肿瘤细胞的产生。

【关键词】　卵巢上皮性肿瘤； DNA倍体分析；Ｐ53

卵巢上皮的良性及恶性肿瘤为在临床十分常见,仅以组织细胞学形态为根据判断其良、恶性有一定的困难，有时甚至会导致误诊^【1】。为了对卵巢上皮性肿瘤(EOT)患者的DNA含量进行分析，并探讨与P53蛋白表达的关系，本研究使用流式细胞术对良性及恶性卵巢肿瘤进行DNA倍体分析,并使用免疫组化检测P53表达,以期为临床诊断提供指导。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择于2012年11月到2015年10月到我院进行治疗的140例卵巢上皮性肿瘤患者作为研究对象，患者年龄最小为34岁，最大为70岁，平均为（48±12）岁。140例患者中,有68例为卵巢浆液性肿瘤,其中18例患者为良性囊腺瘤，20例患者为交界性囊腺瘤,30例患者为浆液性囊腺癌；有72例患者为卵巢黏液性肿瘤,其中28例患者为良性囊腺瘤,18例患者为交界性囊腺瘤,26例患者为黏液性囊腺癌。所有病理组织标本均采用石蜡进行包埋。

1.2 方法

1.2.1流式细胞术:①首先需制备好石蜡包埋组织的单细胞悬液:将50μm厚的石蜡包埋组织进行连续切片，共计5张,后使用二甲苯进行脱蜡，时间为48小时；然后用体积分数分别为1.00、0.95、0.70、0.50的乙醇梯度水化；再加入3ml胶原酶消化液,放在37℃恒温水浴中消化，时间为30分钟；使用尼龙网进行过滤,将细胞悬液仔细收集,每分钟1500转离心沉淀；使用PBS液进行漂洗,每分钟1000转离心沉淀。所有标本制备细胞悬液涂片,涂片要确保可以在镜下观察并存有完整细胞核^【2】；再用BECKMAN COULTER公司提供的DNA倍体分析试剂行核酸染料标记DNA，30分钟之后使用流式细胞仪检测分析,对细胞各个时期的分布状态进行记录,计算出G0/G1%,S%及G2/Ｍ%；②行DNA倍体分析:使用细胞周期及DNA分析软件对记录的各项指标进行分析。如果在DNA指数（DI）1.0±2CV间(0.90～1.10)即为二倍体（DT）,否则为异倍体（AT）。

1.2.2免疫组化检测:一抗选择从SANTACRUZ购买的鼠抗人P53单克隆抗体,工作浓度为1：100,具体的实验方法按说明书操作。阳性对照选择乳癌P53阳性患者，阳性的判断标准为:P53阳性信号为棕黄色颗粒状,在细胞核处；若阳性细胞数小于1%则为阴性,若阳性细胞数在1%～24%则为阳性^【3】。

1.3 统计学方法:对收集到的资料采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计数资料采用X²检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

卵巢上皮性肿瘤患者DNA倍体分析结果及P53的表达情况显示如下：交界性卵巢上皮性肿瘤与良性卵巢上皮性肿瘤相比较AT及P53阳性率均为P<0.01,差异有统计学意义；交界性浆液性卵巢上皮性肿瘤与交界性黏液性卵巢上皮性肿瘤相比较AT阳性率P<0.05,差异有统计学意义；P53蛋白阳性率均为P<0.01，差异有统计学意义；癌性卵巢上皮性肿瘤与良性卵巢上皮性肿瘤及交界性卵巢上皮性肿瘤三者相比较AT及P53蛋白阳性率均为P<0.01，差异有统计学意义。详见表1。

表1

肿瘤类型	例数	DT	AT	P53蛋白
良性浆液性	18	100	0	0
良性黏液性	30	100	0	0
交界性浆液性	20	65	35a	16a
交界性黏液性	18	83	17b	0a
浆液性癌	28	25	75a	61
黏液性癌	26	38	62a	65a

注：P^b<0.05,P^a<0.01。

3 讨　论

在所有引起恶性肿瘤的原因中，抑癌基因P53的突变占到了50%以上。若正常细胞DNA受到外源性或内源性损伤,P53蛋白的含量就会相应提高,并会使受损细胞在G1期产生阻滞，进而诱导程序性凋亡；若受损的细胞得以修复或清除,P53蛋白含量在细胞中则会恢复到正常水平^【3】，从而维持了基因组的稳定。

DNA异倍体是由多基因、多步骤相互作用而形成的,本研究中使用的流式细胞术是一种研究P53表达及DNA倍体的最简便直观的方法。研究表明，P53阳性表达与DNA异倍体间有很明显的相关性，即DNA的异倍率越高,则P53阳性表达率就越高^【4】。DNA重排畸变会导致基因出现不稳定,异常DNA倍体就会出现在患者的癌前病变细胞中^【5】。寻找DNA含量与癌基因蛋白之间的关系,也许能够找到诱导细胞转化的原因^【6】。此次的研究也显示,良性肿瘤患者无一例P53表现出阳性,恶性肿瘤P53表达为阳性，两者相比较差异有统计学意义 (P<0.05)。对数据进行分析显示,P53阳性表达与DNA异倍体有明显相关的关系，且差异有统计学意义(P<0.001),说明P53的表达与否和肿瘤良恶性相关。

综上,我们认为P53阳性表达与DNA异常有密切相关的关系,可能是因为抑癌基因P53蛋白失去活性,对DNA异变细胞失去修复排除功能,由于错配的累积，基因组变得不稳定，遗传信息也发生改变，最终导致肿瘤的产生。

参考文献

【1】郝风云,张景芳,张采欣,纪祥瑞.周围神经肿瘤ＤＮＡ倍体分析及Ｐ53表达意义.齐鲁

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【2】张凤艳，张金子，邹树彪，等. 胃癌组织中P21 P27 P53 和RB的表达及临床意义.临床与实验病理性杂志，2011,(27):586-589.

【3】姚军，曾永群，黄健. P27、P53蛋白在卵巢癌组织中的表达变化及意义.山东医药.2009（49）:63-66.

【4】Gajewska Małgorzata, Wielgoś Mirosław, Panek Grzegorz, et al. Incidence of proapoptotic proteins p53 and p21 in epithelial ovarian tumors. Ginekol Pol. 2014，85(2):111-6.

【5】Chmelarova Marcela, Krepinska E, Spacek J, et al. Methylation in the p53 promoter in epithelial ovarian cancer. Clin Transl Oncol. 2013，15(2):160-3.

【6】崔斩霞，王海军惠起源.P53 胃粘膜不同病变组织中突变型 E=G 蛋白表

达的研究.延安大学学报( 医学科学版)，2008（6）:3-4.