瘦素在大鼠气道平滑肌细胞凋亡中的作用

何淑敏1宋立坤2郑金艳3孙茂明1王振1

摘要：目的：探讨瘦素（OB）对大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）凋亡的影响。方法：体外培养大鼠ASMCs，RT-PCR和Westernblot法测ASMCs瘦素受体（OB-R）的表达。不同浓度OB（0、20、40、60、80及100ng/ml）干预培养大鼠ASMCs不同时间（1、12、24、48及72h）后，Annexin-VFITC/PI双染色法测细胞凋亡率。结果：20-100ng/mlOB作用ASMCs于48h后，各浓度组细胞凋亡率与对照组相比无统计学意义，P>0.05。结论：OB对体外培养的大鼠ASMCs凋亡无明显影响。

关键词：瘦素；气道平滑肌细胞；凋亡

哮喘主要由气道重塑造成，气道重塑主要表现为上皮细胞粘液性化生、ASMCs增生和肥大、上皮下的纤维化、血管形成增加、细胞外基质沉积等。多项研究表明OB在哮喘发病机制中有重要作用，OB对ASMCs的作用尚无报道。本实验观察OB对大鼠ASMCs凋亡的影响。

1资料与方法

1.1研究对象170gSD大鼠1只/徐州医学院实验中心；DMEM培养基/Gibico；胎牛血清/四季青；胰蛋白酶/Sigma；OB/Alexis；兔抗大鼠OB-R的抗体/博士德；CCK-8试剂盒/凯基；TRNzol总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒/天根。

1.2方法

1.2.1大鼠ASMCs的培养麻醉大鼠，无菌下纵剖大鼠气管，剥离外膜内膜，剪lmm×1mm×1mm块，贴培养瓶底面，加200mL/L胎牛血清的高糖培养基培养、换液、传代，选4-6代细胞。

1.2.2细胞鉴定-免疫荧光染色法将消毒玻片置六孔培养板孔内，细胞入孔，加2mL高糖培养基。细胞融合50-60%时取出玻片，固定，100mL/L山羊血清封闭非特异性抗原，抗SMC-α-actin室温孵育2h，荧光标记二抗，4℃孵育细胞过液，封片后在荧光显微镜下检测。

1.2.3OB-R的mRNA测定收集未经OB干预的ASMCs，TRNzol法提取细胞总RNA，紫外分光光度法测RNA浓度。用一步法RT-PCR反应体系。

1.2.4ASMCs增殖的CCK-8测定取第5代ASMCs，2.5g/L胰酶消化，计数，细胞活性大于95%。将ASMCs按1×104细胞/孔种于96孔板培养24h，换无血清培养液培养24h，再换10mL/L胎牛血清培养液。细胞随机分6组：对照组及20、40、60、80、100μg/L的OB处理组，每组6复孔，培养1、12、24、48、72h，每孔加10μLCCK-8培养2h，波长450nm测各孔OD值。

1.2.5ASMCs凋亡的测定Annexin-VFITC/PI双染色法测细胞凋亡率。

1.3统计学方法用SPSS17.0分析数据，计量资料±s，组间比较用单因素方差、q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

20-100ng/mlOB作用ASMCs于48h后，各浓度组细胞凋亡率与对照组相比无统计学意义，P>0.05，表1。

3讨论

OB是由白色脂肪细胞分泌的多肽类激素，通过与OB-R结合发挥生理作用：参与调节摄食、能量代谢、激素分泌、生长、生殖和免疫等功能，其可促进ASMCs和肥大细胞产生中性粒细胞趋化因子、TNF-α、IL-1α、IL-6等炎症因子[1]。Bohlen[2]等发现增加OB浓度50或100ng/ml可显著下调短型OB-R亚型，抑制血管平滑肌细胞增殖。Huang[3]等发现OB诱导大鼠动脉平滑肌细胞增殖致动脉内膜增厚和血管重塑。OB增高可使哮喘危险性增加[4]。OB对血管、ASMCs凋亡的作用尚无报道。本实验研究不同OB浓度干预的ASMCs凋亡率，发现OB对体外培养的大鼠ASMCs凋亡无明显影响。

参考文献：

[1]MaiXM，ChenY，KrewskiD.Doesleptinplayaroleinobesity-asthmarelationship.Pediatrallergyimmunol，2009，20：207-212.

[2]BohlenF，KratzschJ，MuellerM，etal.Leptininhibitscellgrowthofhumanvascularsmoothmusclecells.VasculPharmacol，2007，46：67-71.

[3]HuangF，XiongX，WangH，etal.Leptin-inducedvascularsmoothmusclecellproliferationviaregulatingcellcycle，activatingERK1/2andNF-kB.ActaBiochimBiophysSin，2010，42：325-331.

[4]DubeyL，HesongZ.Roleofleptininatherogenesis.ExpClinCardiol，2006，11：269-275.