人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比

王玉红王妍妍李强

【摘要】目的比较疑似强直性脊椎炎（AnkylosingSpondylitis,AS）患者HLA-B27检测方法的特点，探讨不同检测方法之间差异及各自优缺点，为临床检验提供参考。方法采用最常见微量淋巴细胞毒试验（MLCT），ELISA法，流式细胞仪法（FCM），对120例疑似（AS）患者的HLA-B27抗原进行检测。将三者结果进行比较分析。结果微量淋巴细胞毒法检测强直性脊椎炎患者阳性率HLA-B27为39.2%；ELISA法检测HLA-B27阳性率45%；流式细胞仪法检测HLA-B27阳性率40.8%。结论三种检测方法之间具有较高的一致性

【关键词】强直性脊椎炎人类白细胞抗原B27

人类白细胞抗原（HLA-B27）是组织细胞上受遗传控制的个体特异性抗原，其位于人的第6号染色体HLA.基因B座位点上27等位基因[1]。主要症状为腰疼、脊椎僵硬、运动受限。X线显示有两侧骶髂关节炎为其特征的疾病.笔者对疑似AS患者，采用不同的实验方法进行HLA-B27检测、比较，以便为临床提供更准确的诊断依据。

1一般材料

选择本院门诊或住院主诉腰疼、关节疼的患者120例，男56例，女64例，年龄14～56岁，平均年龄36.8岁，按不同的实验要求抽取恰当的血标本备用。

2试剂与方法

2.1微量淋巴细胞毒试验（MLCT）

原理：待检的淋巴细胞表面的HLA—B27抗原与已知的HLA—B27抗体结合，在补体的参入下，导致细胞膜溶解，能透过染料使细胞着色，在显微镜下判断HLA-B27为阳性，不着色为阴性。

试剂与器材：

（1）试剂：肝素抗凝剂；淋巴细胞分离液（上海试剂二厂生产）；HLA—B27六孔抗体反应板检测板；兔补体；染色液；固定液。

（2）器材：10ml玻璃试管；玻璃吸管或一次性塑料吸管；离心机；冰箱；恒温箱；连续1ul加样器；连续5ul加样器；普通显微镜或倒置显微镜。

方法：

（1）抽取静脉血5ml用肝素抗凝。

（2）用缓冲液将抗凝血2—3倍稀释、混匀。

（3）加于装有2ml淋巴细胞分离液试管中的液表面上。离心20分钟。

（4）吸出淋巴细胞层于另一试管，加缓冲液洗涤三次，离心2000转/分，10分钟。

（5）调细胞浓度为2.5—3.0×106/ml。

（6）取出HLA—B27反应板，几分钟复温后，将淋巴细胞悬液加于HLA—B27反应孔，每孔1ul，放置22±2℃，30分钟。

（7）兔补体于每反应孔中加5ul，22±2℃，60分钟。

（8）加染色液5ul，5分钟后加5ul固定液固定细胞。

置室温2小时后观察结果。

结果判断：

在普通显微镜低倍视野观察反应孔中细胞。阴性：活细胞，呈圆球形，闪光，不着色。阳性：死亡细胞，扁圆形，不闪光，着色。死亡细胞率在50%以上为阳性孔，3个以上反应孔阳性者，可报告HLA—B27阳性。

2.2ELISA法测定HLA-B27

方法：样本血清101倍稀释；分别取10ul稀释样本血清和标准品（直接用）10ul分别加入反应板孔中，每孔加入100ul酶联物，混匀，室温45分钟，馏水洗板5次；每孔加入100ul终止液混匀，5分钟后，30分钟内，酶标仪上450nm波长测定OD值，从标准曲线上查出浓度。HLA-B27<35U/ml为阴性,HLA-B27>35U/ml为阳性。

2.3流式细胞术（FCM）流式细胞术所用HLA-B27试剂盒、溶血素及流式细胞均为BD公司产品；利用流式细胞仪对细胞进行分选，进行快速分析。流式细胞术测B27的方法是取50ul抗凝血加入1:10稀释的裂解液，去红细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，再离心弃上清，调整细胞悬液加入30ul的抗HLA-B27FITc/CD3PE，室温避光15分钟，上机测定，以标记阳性细胞数大于90为B27阳性。

表：MLCT、ELISA及FCM3种方法120例疑似脊柱炎患者的HLA-B27结果

3讨论

强直性脊柱炎(AnkylosingSpondylitis,AS)是一种慢性、进行性和炎性疾病,主要累及骶髂关节及四肢关节,表现为关节炎症和增生,晚期关节融合,病人出现疼痛,活动受限,严重者失去劳动能力。过去曾把AS误认为类风湿关节炎的一个亚型。研究发现，AS患者中B27阳性显著高于正常人，而类风湿关节炎患者中HLA-B27频率与正常人无显著差异，这就从遗传学角度证明AS与类风湿关节炎不是一种疾病。因此认为HLA-B27的检测可作为AS的筛选方法[2]。目前检测HLA-B27的方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试验、玫瑰花法，ELISA法，流式细胞术法、PCR／SSP法等[3,4]。在此，笔者选择微量淋巴细胞毒试验、ELISA法、流式细胞术法三种方法检测比较发现：试验结果有较高的一致；相对来讲MLCT法与FCM法ELISA法阳性检出率略高于微量淋巴细胞毒试验法；ELISA法和MLCT法采用的抗体制备法不一样，其HLA-B27抗原结合位点也不相同，且HLA-B27的亚型多达22种以上；ELISA法检测的是血清中的含量，而MLCT法检测的是淋巴细胞上HLA-B27的表达，在表达水平上有差异。总之MLCT、ELISA、FCM三种方法结果有较高的一致性。其中ELISA法操作简便，标本易取，不需要细胞，可保存，适合大批检测，但试剂较贵，较少用；流式细胞术法，快速、准确，但试剂和仪器昂贵；补体依赖性微量淋巴细胞毒法结果稳定可靠，仪器简单，试剂已商品化，是目前通用的方法，适合各级医院开。总之，笔者认为，在选择试验方法的同时，更需密切结合临床及影像质料，综合分析判断，减少漏诊、误诊，提高诊断水平。

参考文献

[1]BrewertonDA,CaffreyM,HartFD,etal.AnkylosingspondylitisandHLA-B27.Lance,t1973,1(7809):904.

[2]LeveringWH,WindH,SintnicolaasK,eta.lFlowcytometricHLA-B27screening:cross-reactivitypatternsofcommerciallyavailableanti-HLA-B27monoclonalantibodieswithotherHLA-Bantigens[J].Cytometry,2003,54:28-38.

[3]张铁汉、杨秀珍、王莉莉等ELISA法检测HLA-B27抗原的表达及意义。中国现代药物应用，2008，6（1）:35.

[4]李维,王跃华,府伟灵,等.流式细胞术检测HLA-B27抗原的表达及意义-与微量淋巴毒实验的比较.重庆医学,2006,35(11):977