β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中的表达

解龙川1,2胡孝丽2*张文峰1冷卫东2罗志晓2

(1.武汉大学口腔医学院湖北武汉430079；2.郧阳医学院附属太和医院口腔科湖北十堰442000)

基金项目:山东省自然科学基金资助项目(编号:Y2005C64)。湖北省十堰市科技局项目(编号:2009s20)。

作者简介：解龙川（1974.4-），男，口腔医学硕士研究生。研究方向：口腔临床医学。

【摘要】目的:观察β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中的表达情况及意义。方法:体外分离、培养和纯化鼠切牙颈环上皮细胞，以β1整合素多克隆抗体为一抗，进行免疫组织化学染色。结果:颈环上皮细胞呈多角形，克隆状生长，免疫组织化学染色发现β1整合素在鼠切牙颈环上皮细胞中呈阳性表达。结论：鼠切牙颈环上皮细胞中富含干细胞，β1整合素可作为颈环上皮干细胞的标记物。

【关键词】颈环；上皮细胞；细胞培养；β1整合素

【中图分类号】R392.3【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）08-0119-02Theexpressionofintegrin-β1incervical-loopepithelialcellsofWistarratlowerincisors

XieLongchuanHuXiaoliZhangWenfengLengWeidongLuoZhixiao

【Abstract】Objective:Toobservetheexpressionofβ1-integrinincervical-loopepithelialcellsinWistarratlowerincisorsanditsmeaning.Methods:Thecervical-looptissueswereculturedinviroandpurified.Thepurifiedcellswerethenidentifiedbyimmunohistochemi-strystaining.Results:Thecervical-loopepithelialcellsarepoly-angleandcloneformation.Thecervical-loopepithelialcellsexhibitpositiveexpressionforintegrin-β1inimmunohistochemistrystaining.Conclusion:Thecervical-loopepithelialcellsarerichinginstemcellsinratlowerincisors.Integrin-β1canbeamarkeroftoothepithelialstemcells.

【Keywords】cervical-loop；epithelialcell；cellculture；integrin

-β1整合素β1(β1－integfin)主要使干细胞与其周围的细胞外基质黏附维持其自身的稳定性。它与其配体相互作用可以为干细胞的分化、增殖提供适当的微环境并控制干细胞的增殖和分化，因此它是上皮干细胞研究常用的标记物之一。上皮干细胞具有通过整合素(integrin)与基膜黏附的特性，整合素表达降低表明该干细胞脱离该干细胞群并进入了分化。整合素可以定位追踪干细胞。而标记物的确立对于上皮干细胞的分离、鉴定及功能特性的研究有重要意义。目前关于integrin-β1在鼠下切牙齿颈环结构发育中的表达情况还没有系统的报道。本实验通过对大鼠下切牙颈环上皮细胞中integrin-β1的表达研究来探讨其意义。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器：DMEM-F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（均购置于Gibco,美国）。BCM型生物洁净台（北京），HH.B1.1-420BS型电热恒温培养箱（日本），SZX研究型体视显微镜（日本），OLYMPUSCX71显微镜及数码成像系统（日本）。

1.2方法

1.2.1胰酶-葡萄糖-庆大霉素（trypsin-glucose-gentamicin，TGG)细胞消化液的配制[1]以PBS液100ml溶解0.1g葡萄糖及0.25g胰蛋白酶，经0.2μm滤膜过滤后，加入0.5μg/ml庆大霉素，置-20℃冻存待用。用前与已灭菌的0.02%EDTA(PBS液溶解)按1∶1比例混合。

1.2.2鼠尾胶原制备：从大鼠根部剪断大鼠鼠尾，自来水、蒸馏水清洗后，放入75%乙醇中浸泡30min，在超净工作台中将鼠尾切成1.5cm小段，剥去鼠尾皮毛，抽出尾腱，置于玻璃皿中。用眼科剪剪碎肌腱，转移入0.1%醋酸溶液中，密封，置4℃冰箱，并不时摇动。48h后移入灭菌的离心管中，以4000r/min，30min离心，无菌条件下吸取上清液，-20℃冰箱中冻存。应用时用玻璃吸管将解冻的鼠尾胶原均匀涂布于培养皿底部，37℃孵箱过夜，用灭菌D－hank’s漂洗，超净工作台内晾干。

1.2.3Ⅳ型胶原包被培养皿：用20ug/ml的Ⅳ型胶原溶液1ml铺35mm培养皿的底部，置入4℃冰箱过夜，第2天吸掉未干燥的残留溶液，置37℃孵箱30min备用。

1.2.4原代细胞分离培养：取10只出生2天的Wistar大乳鼠，脱颈处死后在75%的乙醇中浸泡5min，体视显微镜下分离下切牙牙胚，置入2.5g/L的胰酶，4℃消化1.5小时，放入盛有含胎牛血清的培养基中终止消化。体视显微镜下机械剥离成釉器，并分离出颈环组织，置入鼠尾胶包被的培养皿，加入少量培养基，保持组织块湿润即可。置入37℃、50ml/LCO2、饱和湿度标准条件下孵育，3小时后加入3ml培养基，隔日换液。

1.2.5颈环上皮细胞的纯化:待上述培养的细胞铺满培养皿底,并计数为1×106/ml后,加入TGG37℃下振荡消化10～15min，10%FBS终止消化，1000r/min离心，弃上清，加入培养基，移至鼠Ⅳ型胶原包被的培养皿内，37℃下静置10～15min，待细胞贴壁后，更换培养基，置37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养，隔日换液。经3-5次换液，更换鼠Ⅳ型胶原包被的培养皿，并重复上述过程。

1.2.5颈环上皮细胞的免疫组化染色:对纯化的细胞常规制备细胞爬片，一抗为兔抗鼠的β1整合素多克隆抗体，用0.1ml/L的PBS液替代一抗作空白对照。免疫化学染色过程按检测试剂盒说明,观察所培养细胞免疫细胞化学染色的情况。

2结果

2.1原代细胞分离培养:体视显微镜下分离下切牙牙胚，可见清楚的颈环结构(图1)，组织切片可见内釉上皮、外釉上皮和中间层细胞(图2)。培养24小时观察，可见少量细胞游出组织块。原代培养细胞为混杂细胞，包括形态、排列明显不同的两种细胞：一种为纤维样的细胞，呈长梭形，细胞间较分散；另一种为上皮细胞，呈多角形，细胞连接紧密，呈克隆状生长。上皮细胞被成纤维样细胞包围，呈“岛”样分布(图3)。

2.2颈环上皮细胞的纯化:经2-3次更换Ⅳ型胶原包被的培养皿，纤维样细胞被完全除去，贴壁细胞全部是上皮细胞，体积较小较圆，胞浆丰富，胞核大，含2～3个核仁，长满后细胞密集排列为多角形，能够形成较大的克隆(图4)。

2.3免疫组织化学的检测:颈环上皮细胞β1多克隆抗体染色阳性，细胞胞浆内出现红色着色的阳性表达，空白对照组染色阴性(图5)。

3讨论

整合素是由α亚单位和β亚单位以非共价键连接而成的异二聚体的跨膜蛋白，目前已知至少有16种α亚单位和l1种β亚单位，组成至少20多种不同的整合素。整合素受体细胞内区与胞浆内肌动蛋白细胞骨架相连，细胞外区与基质蛋白或其他细胞上的特异性配体的精-甘-天冬氨酸(Arg-gly-Asp，RGD)结构结合，形成配体-整合素-细胞骨架跨膜信息系统，从而将细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)和细胞骨架连接起来，引起细胞内一系列生化改变，进而影响多种组织细胞功能的调控，包括胚胎发育、细胞凋亡、分化、增殖、迁移、粘附、组织免疫反应、创伤修复和血小板凝集等一系列病理生理过程[1,2]。整合素起双向信号传送作用：一方面介导来自ECM的信息影响细胞的生存、增殖和分化(由外至内信号)；另一方面，起源于细胞内的信号通过整合素的传送能改变ECM的粘附，影响细胞迁移(由内至外信号)[3]。大多数ECM(如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、波形蛋白、Ⅳ型胶原等)都含有RGD序列，整合素通过α、β亚单位识别ECM中的RGD序列，介导细胞粘附，影响细胞分化和增殖。

不同的α亚基与不同的β亚基组成了多种整合素，其中β1亚基组成的整合素主要介导细胞与细胞、细胞与基质的粘附，在上皮细胞与基底膜的粘附中起重要作用[4]。β1整合素家族是与上皮细胞存活最密切相关的因素之一[5]。β1整合素家族是介导细胞外基质信号最主要的细胞表面受体，与细胞的增生、分化、凋亡和迁移密切相关[4]。

当干细胞微环境发生改变时，细胞外某些信息可通过整合素传递给干细胞，以触发跨膜信号转导，调控细胞的基因表达。这一过程可改变干细胞的分裂方式，而且可激发干细胞的多潜能性，使干细胞产生一种或多种定向祖细胞，以适应组织修复的需要。β1整合素正常表达时，可介导干细胞和细胞外基质黏附，抑制干细胞分化。β1整合素丧失功能时，干细胞脱离微环境的制约进行分化。表面整合素水平下降，细胞失去对基底膜的黏附。所以整合素的表达及干细胞的粘附性是维持干细胞群落所必需的条件，二者的缺失将导致干细胞停止自我更新，进入终末分化[6,7]。

Jones等[8]发现β1整合素表达水平的高低与细胞体外克隆形成能力成正相关，高表达β1整合素的细胞具有更高的克隆形成能力，传代次数显著多于低表达的细胞，将其体外培养可以形成牙釉质和牙本质，表明β1整合素高表达的细胞富含干细胞。本研究结果显示β1整合素在出生2天的鼠下颌切牙颈环组织中高表达，推测在鼠下颌切牙颈环组织中可能存在干细胞。这与荷兰科学家Hidemitsu等[9]的研究结果一致。

由此推测，β1整合素可认为是颈环干细胞的相对特异性标记物。但在正常上皮组织中，上皮干细胞和短暂扩充细胞都有β1整合素的表达，因此需选用其它特异性标记对其进一步鉴别，如P63。目前学术界推荐的方法是，β1整合素染色后呈阳性，且具有干细胞的非成熟特征，如慢周期性、强增殖潜能、强克隆形成力等，即为上皮干细胞。

参考文献

[1]ElnerSG，ElnerVM．Theintegrinsuperfamilyandtheeye[J]．InvestOphthalmolVisSci，1996，37(5)：696-701

[2]ClarkEA，BruggeJS．Integrinsandsignaltransductionpathways：theroadtaken[J]．Science，1995，268(5208)：233-239