梓醇抑制LPS诱导的小胶质细胞的活化

田媛媛王伟吕凌云尹忠慧

（大连金州新区食品药品监督检测中心116100）

【摘要】为探讨梓醇能够有效抑制小胶质细胞引起的炎症反应，本研究采用梓醇预处理原代小胶质细胞，利用细菌内毒素脂多糖（LPS）建立体外小胶质细胞活化的炎症模型，通过检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，一氧化氮(NO)、细胞内活性氧自由基(ROS)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的含量，观察梓醇对LPS诱导的小胶质细胞的影响。结果显示，梓醇能够明显降低活化的小胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，一氧化氮(NO)和细胞内活性氧自由基(ROS)等免疫炎性因子，而且有效的降低了诱导型一氧化氮合酶的表达。本研究结果表明，梓醇可有效地抑制LPS引起的小胶质细胞的活化，具有一定的抗炎作用，为帕金森病的防治提供了一个崭新有效的治疗途径。

【关键词】梓醇小胶质细胞炎症反应

【中图分类号】R74【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）09-0020-02

帕金森病（Parkinson'sdisease,PD）是常见的中枢神经系统变性疾病，越来越多的实验和临床证据表明脑内炎症在为数众多的散发性PD中起着重要作用[1]。脑内炎症的诱因很多，如脑外伤，接触有毒化学物质，农药等。在脑内炎症过程中，活化细胞（特别是活化的神经胶质细胞）产生的细胞因子（cytokine）起了关键的作用[2]。本实验的主要研究目的是检测梓醇对多巴胺能神经元的保护作用是否是通过抑制了小胶质细胞的激活。

1材料与方法

1.1材料

LPS(Ecoli,055:B5)来自Sigma公司。iNOS检测试剂盒来自南京建成生物工程研究所。梓醇来自中国药品生物制品检定所。DMEM/F12培养基来自Gibco公司。出生24小时内的小鼠来自大连医科大学动物中心。其他试剂均为国产分析纯试剂

1.2方法

1.2.1小胶质细胞培养

将出生24小时内的KM小鼠放入冰中冰浴5-10分钟至僵硬；从冰中取出小鼠，放入75%乙醇中浸泡5分钟；取出小鼠，无菌操作下于PBS溶液中取全脑，分离出两个大脑半球，剥除脑膜，除去血管，放入装有培养基的5ml离心管（Eppendorf管）中；机械吹打以分离细胞，1000rpm离心10分钟；弃去上清，加入培养基重悬沉降物，再吹打分离细胞；用血球计数板计数细胞，并以1×106细胞/ml接种到35cm2的T-培养瓶中；细胞培养在5%二氧化碳和95%空气的饱和温度的37℃恒温培养箱中。两天后置换出旧的培养液，继续培养到细胞长满培养瓶(总共大约需要12-14天)，其间约3-4天换一次液（DMEM/F-12+10%胎牛血清）；培养至12-14天的细胞放到恒温摇床中，在180-190r下震摇5-6小时以便使小胶质细胞与星型胶质细胞分离；取出震摇后的细胞悬液，计数细胞并接种到96孔培养板(1×105细胞/0.2ml培养液/孔）中；培养24小时后，可进行实验[3]。

1.2.2一氧化氮(NitricOxide,NO)的测定

小胶质细胞以1×105细胞/孔接种于96孔板中。梓醇（0.05-0.5mM）预处理30分钟后，加入LPS（10μg/ml）作用24小时。一氧化氮（NO）的产生通过培养基中积累的亚硝酸盐与Griess试剂的反应来测定[4]。

1.2.3酶联免疫法检测TNF-α

用不同浓度梓醇处理培养的细胞，收取细胞培养上清液用于检测TNF-α。本实验采用双抗夹心ELISA法，抗TNF-α单抗包被于酶标板上，上清液中的TNF-α会与单抗结合，同时加入生物素化的二抗和辣根过氧化酶标记的亲和素。加入显色剂，若上清中有TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂显蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，通过绘制标准曲线求出TNF-α浓度。

1.2.4测定细胞内活性氧类物质

细胞内活性氧类物质(ReactiveOxygenSpecies,ROS)的含量使用2，7，-dichilorodi-hydrofuorescein(DCFH-DA)来测量的[5]。DCFH-DA能进入细胞内，在酯酶脱乙酰化的作用下变成非荧光的DCFH。经药物处理后的培养在96孔培养板中的纯小胶质细胞用PBS清洗2次，每孔加入100uL的DCFH-DA，37℃孵育30分钟，然后吸出液体，用PBS漂洗细胞三次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。在荧光分光光度仪下，以485nm为激发波长，530nm为放射波长测量荧光强度。以对照组的值作为基线，其他处理组与对照组的差值即为细胞内活性氧类物质的产量。

1.2.5一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase,NOS)活力

iNOS活性通过iNOS试剂盒来测定并按试剂盒操作提示完成。定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmolNO为一个NOS活力单位

计算公式:

iNOS活力(u/ml)＝(iNOS测定管OD值-空白管OD值)&pide;呈色物纳摩尔消光系数(38.3×10-6)

1.3统计分析

所有数据表达为均值±标准差。P<0.05被认为是有统计学意义。

2实验结果

2.1梓醇抑制LPS诱导的小胶质细胞产生免疫炎性因子

用0.05-0.5mM的梓醇预处理30分钟，24小时后，收取上清液与Griess试剂反应，检测梓醇对亚硝酸盐的作用，上清液做ELISA检测释放肿瘤坏死因子-α的量。结果表明，梓醇能够明显减少LPS诱导小胶质细胞产生的亚硝酸盐的量，也有效地抑制了肿瘤坏死因子-α的产生，并且随着梓醇浓度的增加减少的程度也随着增加(图1A,B)。用荧光探针DCFH-DA在纯小胶质细胞培养体系中检测梓醇对细胞内活性氧类物质的作用。结果表明，0.05-0.5mM梓醇能够明显抑制LPS诱导小胶质细胞产生的细胞内活性氧类物质的量，并且呈现剂量依赖性(图2C)。

2.2梓醇预处理抑制LPS诱导的小胶质细胞中iNOS的表达

一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成NO，NO与二价铁配合物（呈色剂）形成有色物。诱导型NOS（iNOS）可长时间释放高水平的NO和超氧自由基。已有报道，在中枢神经系统炎症中iNOS的表达在PD的神经退行性变中起了重要作用[7,8]。iNOS活性的测量依赖于它催化精氨酸生成NO的能力，NO可进一步与亲核基团（二价铁配合物）反应生成发光复合物，并在545nm处有最大吸收峰。对iNOS表达的测量表明，梓醇预处理可剂量依赖性的减少小胶质细胞中LPS诱导的iNOS的表达（图2）。

3结论

研究表明细菌脂多糖LPS引起的多巴胺能神经元变性与iNOS的高表达以及NO的大量释放密切相关[6]。在本研究中，我们发现梓醇抑制了LPS激活的小胶质细胞释放TNF-α和活性氧自由基，此外还降低了NO的产生。初步研究表明，它是抑制了LPS诱导的iNOS的表达。对于进一步研究梓醇抑制TNF-α、NO以及活性氧自由基释放的确切机制是必要的。但梓醇抑制LPS诱导的小胶质细胞的活化，减少前致炎因子产生的事实，为梓醇作为新的神经保护剂提供了依据。

参考文献

[1]张美蓉，孙芳玲等.帕金森病的炎症及抗炎药物的研究进展.中国康复理论与实践.2012,18(11):1040-1043.

[2]DaveA.Gayle,ZaoDungLingetal.Lipopolysaccharide(LPS)-induceddopaminecelllossinculture:rolesoftumornecrosisfactor-α,interleukin-1β,andnitircoxide[J].DevelopmentalBrainRes,2002;133:27-35.

[3]杨忠,何家全等.一种改良的小胶质细胞培养方法及初步研究.创伤外科杂志,2001(3):239-240.

[4]崔思思，陈海燕等.生物体内一氧化氮检测方法与评价.中国药学杂志,2010(20):1524-1527.

[5]周永列,吕亚萍,邱连女等.一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡过程中活性氧自由基和抗氧化能力的变化.浙江检验医学[J],2005(1):26-28.

[6]李文霞.脂多糖与帕金森病模型的研究。国外医学神经病学神经外科学分册,2004,31(3):287-290.

图2梓醇对LPS诱导的iNOS表达的抑制作用