慢性肝炎肝组织中糜酶活性与羟脯氨酸含量的相关性分析

尹明实崔鹤松

【中图分类号】R575.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）37-0074-02

【摘要】目的本论文探讨了慢性肝炎患者肝组织中糜酶活性与羟脯氨酸含量的相关性。方法选择40例慢性肝炎患者，行肝组织活检，按肝纤维化分期分组，肝组织中糜酶活性检测采用ELISA法，肝组织羟脯氨酸含量测定采用胃酶酸解法。结果①慢性病毒性肝炎患者肝组织中糜酶浓度升高，且纤维化分期高的（S3,S4）患者，其肝组织中糜酶浓度分别明显高于纤维化分期低的患者，有统计学意义（P<0.01）；另外，纤维化分期高的（S3+S4）患者，其肝组织中糜酶浓度明显高于纤维化分期低的（S1+S2）患者，两者之间有显著性差异（P<0.01）。②慢性肝炎患者肝组织中糜酶活性与肝组织HYP含量呈正相关性，r=0.672,P<0.01。结论慢性肝炎患者肝组织中糜酶活性与肝纤维化关系密切。

【关键词】慢性肝炎糜酶羟脯氨酸

糜酶（Chymase）是存在于肥大细胞分泌颗粒中的蛋白酶的一种，它在非血管紧张素转换酶（ACE）途径下,使血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）转换成血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)。研究报道，糜酶与心肌、肾间质等的纤维化密切相关[1]。近年研究发现糜酶与肝纤维化关系密切，本研究组的前期研究[2]发现慢性病毒性肝炎患者，随着肝纤维化的进展，其肝组织中糜酶活性升高，提示肝组织中糜酶活性与慢性肝炎肝纤维化相关。羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）是一种非必需氨基酸，是机体胶原蛋白的主要成分之一，几乎所有的HYP都存在于胶原中，HYP含量的测定已成为衡量机体胶原含量的一个重要指标[3]。本研究通过检测肝组织中糜酶活性及HYP含量，探讨肝组织糜酶活性与肝组织HYP含量的相关性。

1材料与方法

1.1临床资料

2009年1月-2011年6月住院的慢性乙型肝炎患者共40例，男22例，女18例，年龄18-68岁（平钧50.04岁）。病人入选标准：年龄15岁以上；慢性HBV感染，血清HBVDNA阳性。排除标准：其他肝炎病毒标志物阳性者；肝硬化、重型肝炎患者。临床诊断标准均参照2000年全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》[4]。

1.2实验方法

1.2.1肝组织活检用16G肝穿针，取米粒大小肝组织标本，一部分放入PBC液中，-80℃保存，待测肝组织中糜酶活性及羟脯氨酸含量。另一部分标本用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，HE、Masson及网织纤维染色，由三位病理医师在共览显微镜下进行肝组织病理学纤维化分期。

1.2.2肝组织中糜酶活性的检测采用ELISA方法[5]。具体步骤如下:于相应96孔反应板中，分别加入标准品或样本各100μl，室温下反应24h，洗净，加入多克隆抗体（OCT10813）5000倍稀释液100μl，室温下反应2h，洗净；再加入HRP溶液100μl室温下反应2h后洗净。最后加入100μl的酶基质溶液，室温下作用10分后加入终止液，在全自动酶标仪上测定。

1.2.3肝组织HYP的测定采用胃酶酸解法，具体方法：①制备标准曲线，酶标仪测定A560nm吸光度；②用微量天平秤取肝组织50mg，匀浆器匀浆；③加入3ml0.5%胃蛋白酶溶液，混匀，37℃保温24h，每个35h混匀1次，使其充分水解；④加入1ml6mmol/L盐酸，120℃高压水解2h；⑤加入40%NaOH调pH至6.0，1200r/min离心15min；⑥500μl上清液加入0.1mol/L的柠檬酸缓冲液和0.05mol/L氯胺-T溶液1ml，混匀室温作用5min终止氧化；⑦加入10%的对二甲氨基苯甲醛溶液1ml，混匀，100℃沸水3min（显色）；⑧冰浴冷却，各管取200μl分别加入酶标板，空白调零，与标准品仪器测定A560nmOD值。

1.3统计学方法应用SPSS11.5统计学软件进行统计学处理，计量资料各变量均采用均数(x-±s)表示，组间比较采用t检验，并采用相关性分析。

2结果

2.1肝组织中糜酶活性与肝纤维化程度的关系

40例慢性病毒性肝炎患者肝脏组织病理观察，纤维化分期分别为：S1为9例，S2为14例，S3为13例，S4为4例。不同的纤维化分期，其肝组织中糜酶活性分别为S1：5.52±4.33（ng/mg）；S2：6.91±5.32（ng/mg）；S3:27.41±21.25（ng/mg）；S4:34.06±27.10（ng/mg），各组间比较，S1、S2与S3、S4之间有显著差异(P<0.01)，见表2.1.1。纤维化轻的S1+S2的肝组织中糜酶活性为5.81±4.53（ng/mg）,纤维化程度重的S3+S4的糜酶活性为31.28±24.43ng/mg，两组间有显著差异（P<0.01）,见表2.1.2。提示肝组织中糜酶活性与肝纤维化关系密切。

注：▽：与S1+S2组比较，P<1.01

2.2肝组织中糜酶活性与肝组织中HYP含量的相关性分析

慢性肝炎患者肝组织中糜酶活性与肝组织中HYP含量成正相关性，r=0.672,P<0.01。提示肝组织中糜酶活性与肝组织HYP含量关系密切。

3讨论

肥大细胞在各种病态的进展，特别是炎症、纤维化的发生与发展过程中起着重要的作用[6]。当肥大细胞与成纤维细胞相互接触或当肥大细胞脱颗粒时，成纤维细胞即发生分裂、增殖，并促进产生胶原[7]。

目前为止，肥大细胞与肝纤维化的关系国内外报道很多。文献报道，慢性肝炎、酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化等，随着肝纤维化的进展，肝组织中肥大细胞分布增多，提示肥大细胞与肝纤维化有关[8]。Yamashiro[8]等对急性肝病、慢性肝病、胆汁淤积性肝病的肝组织进行免疫组化染色研究，结果发现特别是在酒精性肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、肝内胆石症患者的肝组织中，肥大细胞明显增多，而且在纤维增生旺盛的部位肥大细胞明显增多，而在瘢痕化的部位却见不到肥大细胞。

鉴于糜酶主要存在于肥大细胞内，且糜酶与心肌、肾间质纤维化关系密切，本研究探讨了肝组织中糜酶浓度与慢性肝炎肝纤维化的关系。结果，慢性病毒性肝炎患者肝组织中糜酶浓度升高，且纤维化分期高的（S3,S4）患者，其肝组织中糜酶浓度分别明显高于纤维化分期低的患者，有统计学意义（P<0.01）；另外，纤维化分期高的（S3+S4）患者，其肝组织中糜酶浓度明显高于纤维化分期低的（S1+S2）患者，两者之间有显著性差异（P<0.01）。本研究结果还显示肝组织中糜酶活性与肝组织HYP含量呈正相关性，提示肝组织糜酶活性与肝纤维化密切相关。肝脏较原纤维是反映肝纤维化的客观明确指标，在肝纤维化的诊断中有着根本的意义；而羟脯氨酸是衡量机体胶原组织代谢的重要指标，测量羟脯氨酸含量可以较好地反映肝组织胶原的合成情况。

糜酶主要存在于肥大细胞，当有炎症刺激时，肥大细胞即脱颗粒，糜酶即被释放到细胞外，它在细胞外使AngI转换成AngⅡ，而AngⅡ可促进血管平滑肌收缩，并促进成纤维细胞的增殖、肥大和游走，促进产生胶原的细胞外基质，从而促进纤维化的发生[10]。

已经证实在体内许多组织中具有独立的RAS，尤其是近年来分子生物学技术的引进，更进一步证实RAS组分均存在于心、脑、肾、肝、血管等组织中，肝内有独立的RAS系统。RAS在纤维化形成过程中是被激活的，提出了AngⅡ依赖性的肝纤维化形成通道。目前有研究发现，随着肝纤维化程度的增加AT1R荧光标记的阳性的HSC数及AT1RmRNA的表达量均明显增加，而且纤维化肝组织AT1R阳性数明显多于正常肝组织，表明经由AT1R传导的信号在肝纤维化中起重要的作用[11]。最近研究表明[12]，AngⅡ能抑制HSC凋亡，并呈现剂量依赖型，使AngⅡ在促进HSC增殖的基础上，还能延长HSC寿命，保持HSC细胞群的数量，从而促进肝纤维化的发生。

本研究结果显示肝组织中糜酶活性在慢性肝炎肝纤维化过程中起重要的作用，其作用机制有待于进一步研究。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金项目（30960372）