固定对组织细胞抗原性的影响

黎家华

黎家华（三峡大学医学院湖北宜昌443002）

【中图分类号】R392.3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)06-0018-02

免疫组化技术是利用已知的特异性抗体能和抗原特异性结合的特点，通过显色剂使结合部位显色，借助显微镜观察其颜色变化，从而确定组织细胞结构的化学成分或化学性质的一种方法。因此，保存组织细胞的抗原成分在免疫组化中的意义重大。抗原性即物质所具有的能刺激机体产生抗体并能与抗体发生特异性结合的特性，它主要由分布在抗原表面的抗原决定簇决定。组织在固定、脱水、透明、浸蜡、制片以及免疫组化染色过程中，都会使抗原决定簇遭到不同程度的破坏，从而影响抗原活性。本文主要介绍固定这一环节对抗原活性的影响。

1组织细胞固定的作用及其机制

在病理学诊断中，固定是保存组织的第一步。固定一方面使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，防止组织自溶或异溶，更好的保持组织细胞原有的形态结构；另一方面使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原失活或弥散，最大限度的原位保存组织细胞的抗原性。因此，良好的固定是组织学诊断的重要保证。固定一般是通过固定剂使组织之间交联或使组织凝固、脱水，或者通过低温使内源性酶失活而达到目的。

2组织细胞固定对抗原性的影响

固定不及时或固定不当，都会导致组织结构不清晰或组织的抗原性降低甚至消失，从而影响抗原的表达。罗俊铭等[1]以成年大鼠肺神经内分泌细胞（PNEC）为例，研究了三种固定剂（Bouin液、10％福尔马林和4％多聚甲醛与0.25％戊二醛混合固定液）及不同固定时间对降钙素免疫组化结果的影响，计量分析后发现Bouin液保存降钙素抗原性的效果最好，但受固定时间影响较大，以固定4h效果最好，而混合固定剂保存降钙素抗原性的效果最差。熊正文等[2]的研究发现，不论是固定剂的种类还是固定时间，都对小鼠IgG活性有着十分明显的影响。

2.1固定剂对抗原性的影响

不同种类、浓度的固定剂对不同抗原的固定效果不同，对抗原活性的影响也不同。张大红等[3]分别采用4%多聚甲醛、10%甲醛和Bouin液固定大鼠胃窦组织,用免疫组织化学方法结合图像分析技术检测胃窦黏膜内生长抑素和胃泌素的表达，结果提示Bouin液能更好地保存胃窦黏膜内生长抑素和胃泌素的抗原性。古德全[4]研究了7种固定剂分别为10％中性缓冲甲醛（固定24h）、酒精－甲醛（AF）（固定3h）、甲酸钙（Fca）（固定24h），Carnoy氏液（固定3h）、Bouin氏液（固定24h）、Karnorsky氏液（固定12h）、Helly氏液（固定12h）对抗原性的影响，结果表明用同一免疫组化方法，不同固定剂对抗原物质的影响可出现明显差异。

目前常用的组织固定剂有：醛类、醇类及丙酮类固定剂等。

醛类固定剂为双功能交联剂，因醛基与抗原蛋白质中的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间结构发生改变；同时，抗原与其他分子间也会发生交联形成网络结构而掩盖抗原决定簇，降低抗体与抗原决定簇的结合反应，而保存抗原于原位。醛类固

定剂对组织穿透性强，收缩性小，并且对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰。福尔马林是目前应用较广的固定剂，它能很好的保存组织形态结构，对绝大多数抗原有很好的固定作用，但其放置过久易氧化成甲酸，使溶液呈酸性，影响核的染色效果，并且分子间交联形成的网格结构可能影响抗原决定簇的充分暴露，使染色结果假阴性。10％中性缓冲甲醛或多聚甲醛（常为4%）常用于检测组织内一些性能较弱的抗原特别是细胞表面抗原，如各类淋巴细胞分化决定簇、主要组织相容性抗原等，虽然它对保存IgG抗原的作用较差，但若采用合适的抗原修复方法处理，仍是目前提倡的固定剂。戊二醛对组织的微细结构保存好，但对抗原有一定影响，仅用于免疫电镜固定液。

醇类固定剂对组织穿透性很强，能使蛋白质和糖类沉淀，能很好的保存抗原的免疫活性，但其对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。乙醇是最常用的醇类固定剂，它通过脱水、变性和凝固作用使组织固定，而且不改变分子结构[5]。乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解，因此，对很多抗原起不到很好的固定作用；在染色过程中，若温育时间长，则抗原会流失而减弱反应强度。乙醇作为固定液虽不与蛋白质抗原分子中的氨基交联形成羧甲基，但对抗原性也有很大的破坏作用，其机制有待于进一步研究。

丙酮保存抗原性较好，但其组织穿透性和脱水性均很强，常用于冰冻切片及细胞涂片后的固定。

用于免疫组化的固定剂种类很多，不同抗原的稳定性不同，因而对固定剂的耐受性也有较大差异。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失，而HBsAg相对较稳定，抗原活性不易丧失。因此，要根据不同的研究目的以及不同的抗原选择最佳固定剂。一般对蛋白质抗原的固定多采用4%的中性甲醛溶液和4%多聚甲醛。病理标本中一般应用10%中性福尔马林作为常规固定剂。

2.2固定液PH值对抗原性的影响

抗原在不同PH值的固定液中，等电点将发生改变，与抗体结合的基团表面的电荷也会改变，势必影响与抗体的结合，造成染色强弱不同。在酸性PH值下，组织中血红蛋白与其他产物相互作用可形成福尔马林色素(酸性甲醛羟基血红素)，在免疫组化染色中易被误认为是阳性物质；若pH值>8.0，则抗原物质破坏，免疫组化染色定位差，易产生背景着色，影响结果判断。杨京平等[6]的实验证实，用中性或微碱性缓冲福尔马林固定液效果最佳，因为在中性pH值下能够显著地增加对铁离子的检出速度,可完全避免福尔马林色素形成，减少人工假象。

2.3固定时间对抗原活性的影响

固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般认为，适宜的固定时间为1-12h，在这段时间内可使抗原保存完好。固定时间过短或过长均会影响细胞的通透性，不利于染色时抗体

渗透，从而影响抗原的活性以及免疫组化染色结果；固定不足，组织中心部位的一些抗原易溶解﹑弥散﹑丢失；固定时间过久，则所形成的交联越紧密，抗原越难以被激活。

杨毅等[7]选择0.5小时至10年间的23个固定时相点的人体正常胃组织标本，用7种常用抗体进行标记，发现在组织固定1小时至数年内，多数组织成分对其相应抗体有阳性表达，但固定时间过久则免疫组化染色减弱或消失；抗原不同对甲醛的耐受时间也不同（2周至6年），若经适当的抗原修复，固定10年的标本也有抗原的阳性表达。另外，若固定胃壁全层组织（长1.5cm，宽0.3cm）少于1小时，则抗原保存较少，免疫组化染色很弱且定位不准。熊正文等[8]以0.6cm厚的组织为例，研究认为用10%福尔马林在室温固定4.275小时就能达到目的，而且抗原性受破坏程度也轻。另外，他认为[2]活检材料以10%缓冲福尔马林固定3-6小时为最佳条件，最长不要超过12小时。Helander[9]的研究提示小于2-3mm的组织标本，在甲醛中固定24小时就可以充分固定。乙醇脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

2.4固定方法与抗原活性的影响

2.4.1灌注法（Irrigationmethod）

此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注动物于4℃冰箱内，然后取出组织。外周组织一般在灌注后30min内取材，取组织置同一固定剂中浸入1-3h，然后修整组织块。一般光镜下观察的标本室温固定即可获满意效果，也有主张用冷固定剂（4℃）进行灌注。肽类抗原活性在断绝血液供应后24h几乎完全丧失，因此，保持组织新鲜是很重要的。

灌注法可使固定液迅速达到全身各组织，以达到充分固定的目的。灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。

2.4.2浸入法（Immersionmethod）

浸入法即将组织浸泡在固定液内，主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定，必要时也可在低温（4℃）环境下进行。

3组织细胞固定原则

3.1针对不同抗原选择最佳固定剂。

3.2标本离体后及时固定，力求保持组织新鲜，勿使其干燥。

3.3组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是厚度必须控制在0.3cm以内。

3.4固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上。

3.5组织固定后应充分水洗，以减少人为假象。

4结语

目前在病理实验室一般使用“双固定”，即先将组织浸入10％的甲醛，然后再浸入酒精中，使组织充分固定。而在医院病理科，常用10％的甲醛固定组织标本。总之，免疫组化中组织标本的固定应根据研究目的和不同的组织抗原选择适宜的固定剂，并在保持组织细胞形态完好和所测抗原稳定性的前提下，尽可能采用最低浓度的固定剂和最短的固定时间。

参考文献

[1]罗俊铭,钱仲,谭爱玲，等.固定剂和固定时间对保存肺神经内分泌细胞降钙素抗原性的实验研究[J].湖南医科大学学报,1995,20(1):77-79.

[2]熊正文,王伯沄,李达，等.固定对IgG抗原活性的影响[J].临床与实验病理学杂志,1999,15(3):263-264.

[3]张大红,王琳,李庆明.不同固定剂对免疫组织化学染色效果的影响[J].实用医技杂志,2005,12(1):155-156.

[4]古德全.固定对免疫组织化学反应的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,1997,6(1):78-80.

[5]SrinivasanM,SedmakD,JewellS.Effectoffixativesandtissueprocessingonthecontentandintegrityofnucleicacids[J].AmJPathol,2002,161(6):1961-1971.

[6]杨京平,张燕,钟延丰，等.固定液及抗原修复液pH值对免疫组化染色的影响[J].北京大学学报(医学版),2003,35(1):87-90.

[7]杨毅,陆江阳.标本固定时间对免疫组化染色结果的影响[J].诊断病理学杂志,2005,2(3):233-234.

[8]熊正文,王伯沄,丁华野.影响免疫组织化学抗原性的因素分析与对策[J].诊断病理学杂志,1997,4:171.

[9]HelanderKG.Kineticstudiesofformaldehydebindingintissue[J].BiotechHistochem,1994,69(3):177-179.