内皮祖细胞与新生血管生成

李倩

南宁95178部队医院530050

【摘要】内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）是一类可以从骨髓动员入血，聚集至血管受损部位以参与血管形成的细胞群。由于缺乏独特的表面标记和分离方法，EPCs包含骨髓和内皮来源的一大类异质性细胞群。研究表明EPCs在出生后血管形成和血管内稳态中发挥关键作用，为血管性疾病提供新的治疗思路。然而，EPCs参与新血管形成的机制仍不完全清楚。我们回顾了EPCs参与新生血管形成的生物学过程，包括EPC的动员、迁移、粘附和在新血管形成中的作用，以便更好的理解EPC在血管形成中的作用机制，为血管性疾病治疗提供新的治疗思路。

【中图分类号】S891+.1【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-04-356-02

1前言

血管损伤性疾病具有高发病率和死亡率的特点。受损内皮的有效修复和新生血管生成是这类疾病的治疗关键。当内皮完整性破坏，内皮细胞（endothelialcells，ECs）从邻近血管中增殖和迁移，促使受损血管内皮修复。以往认为这是新血管形成的唯一方式。然而，这种血管形成的传统观念目前正面临挑战。Asahara[1]等第一个描述了骨髓来源的细胞群体有助于新血管形成，并命名这一细胞群为内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）。相对于血管形成，来源于骨髓并增殖和分化成熟的EPCs形成的新血管被定义为血管发生。因此，EPCs被认为是治疗血管性疾病的新方法。然而，由于缺少表面标志，这些祖细胞代表了包含骨髓和内皮来源的异源性细胞群。最近针对EPCs的研究主要包含三种细胞类型，分别为克隆形成单元细胞（colony-formingunit-Hill，CFU-Hill）、循环的血管源细胞（circulatingangiogeniccells，CACs）和内皮克隆形成细胞（endothelialcolony-formingcells，ECFCs）。CFU-Hill细胞和CACs通常指早期成熟的EPCs。相对的，ECFCs被定义为晚期成熟EPCs。早期成熟的EPCs和晚期成熟的EPCs均有助于新血管形成，但这类骨髓源性EPC诱导血管生成的机制仍不清楚，需要进一步研究。

2内皮祖细胞的动员

有研究显示外周循环中的EPCs在生理状态下水平很低，大部分EPCs在骨髓微环境中由结合素粘结在骨髓基质细胞中。EPCs由骨髓动员至外周循环是其参与血管形成的关键步骤，但其动员的关键机制仍不完全清楚。有研究显示EPC在各种细胞因子的作用下可由干细胞转变为功能细胞。

血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是一种功能复杂的细胞因子，在血管形成过程中具有重要调节作用。VEGF可通过动员骨髓中的EPCs而促进新生血管生成。在人类受试者中转染VEGF基因可上调循环EPCs水平。在烧伤部位，血浆中VEGF水平升高可动员VEGFR2+的EPCs进入循环。另外，VEGF具有上调粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）的作用。G-CSF可诱导祖细胞从骨髓释放。VEGF和VEGFR相互作用可使骨髓NOS活化，从而产生一氧化氮（nitricoxide，NO），进而激活MMP-9。活化的MMP-9有利于释放可溶性Kit配体（sKitL），增强VEGFR2+的EPCs动员，刺激这些细胞从骨髓向外周血循环迁移。

炎症趋化因子CXC作为关键调节因子在动员骨髓干细胞或祖细胞进入外周循环中发挥作用。基质细胞趋化因子-1（Stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1）是EPC动员最具特征的活性因子，也是EPC粘附和迁移的潜在细胞因子，它在血管生成中具有促进作用，而某些刺激如炎症和乏氧可促使SDF-1表达上调。局部缺血的环境促进SDF-1释放。在缺血发生的第一小时内，局部缺血的内皮细胞中SDF-1mRNA生成增加。血浆中SDF-1刺激CXCR4+骨髓细胞动员，诱导定向造血干细胞和EPCs。CXCR4是SDF-1的一个受体，高表达于定向造血干细胞前体细胞和内皮祖细胞表面。SDF-1和CXCR4相互作用不仅促使EPCs从骨髓动员，而且刺激干细胞向缺血部位募集和固位。SDF-1可由血小板释放，诱导EPCs趋化。EPCs本身也以旁分泌的形式释放SDF-1。血管损伤的第一个反应是血小板向暴露的内皮下膜粘附，借此为干细胞向损伤部位动员和归巢提供靶向信号。在局部缺血的动物模型中，SDF-1α基因转录促进EPCs向外周血动员，增强新生血管生成。但在无损伤时SDF-1是否可动员EPCs仍不清楚。此外，VEGF或NOS信号障碍可阻断SDF-1诱导功能，提示VEGF/eNOS产生涉及新生血管生成中的SDF-1上调。研究显示由骨髓分化的干细胞或祖细胞动员需要骨髓NOS活化，活化的NOS可通过NO-MMP-9可溶性级联信号通路促进骨髓释放祖细胞。SDF-1也可以通过上调VEGF水平增强EPCs的动员，VEGF促进EPCs从骨髓释放入外周循环。白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）是一种炎症因子，最初仅被认为是白细胞趋化因子。然而，最近研究表明IL-8是EPCs动员至外周血的调节因子，在动物模型中这个功能可由G-SCF协同。

一氧化氮（Nitricoxide，NO）被标记为是内皮趋化释放因子，是调节血管生理学特性的关键因子，包括血管舒张、血管通透性和抗血栓形成特性（35）。NO也可通过调节血小板和内皮的相互作用而保持血管完整性和血流。目前研究表明NO是EPC从骨髓动员进入循环，进而促进缺血四肢再灌注和创伤修复的关键决定因子。NO的产生依赖于一氧化氮合酶催化下的L-精氨酸向L-瓜氨酸转化。一氧化氮合酶具有四种亚型：神经元性一氧化氮合酶（nNOS）、可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）、内皮一氧化氮合酶（eNOS）和线粒体一氧化氮合酶（mtNOS）。在这些亚型中，eNOS选择性表达于血管内皮细胞和周围间质干细胞中，在血管生物学中发挥关键作用。NO也可由各种EPC亚型释放。eNOS在调节EPCs动员和功能上发挥关键作用。许多糖尿病患者受迟发性或不愈性肢端症状或糖尿病足困扰，可能与EPCs在高血糖环境下功能受损相关。高血糖使eNOS功能受损，而eNOS功能损伤可致使EPC向周围循环动员受抑。磷酸化eNOS水平，而不是eNOS蛋白水平是阻碍EPCs动员的关键。出生后包括EPCs在内的干细胞存在于骨髓中，由结合素粘附于基质细胞，在细胞因子和其他血管源性因子的作用下释放至外周循环。EPC从骨髓动员的机制仍不完全清楚。NO-MMP-9-sKitL-ckit级联系统可能在这一过程中发挥关键作用。骨髓中eNOS可被这一过程中的多种细胞因子刺激从而产生NO。NO可刺激MMP-9，致使sKitL从基质细胞膜结合配体上释放。EPCs表达的c-Kit有助于维持骨髓内EPCs稳定。c-Kit也是sKitL的配体，结合sKitL后可从骨髓释放，导致c-Kit+的EPCs进入循环。当然，由这些因子诱导的EPCs动员在新血管形成中的机制仍需进一步研究。

3内皮组细胞的迁移

EPCs从骨髓释放并募集至受损部位，促进血管生成和损伤修复。然而，调节EPCs到损伤部位的靶向信号仍不清楚。炎症趋化因子是调节细胞迁移的重要因子。炎症趋化因子CXC参与新血管生成，这些因子可调节血管内皮细胞和EPCs功能，增加这些细胞迁移至受损血管。SDF-1是EPCs最重要潜在趋化物。从外周循环到缺血局部的SDF-1浓度梯度的形成在EPCs迁移中具有重要作用。CXC受体（CXCR4）是SDF-1的主要受体，选择性表达于血管内皮细胞和EPCs表面。研究显示，SDF-1可去趋化各种类型的CXCR4+细胞。它在局部缺血组织中上调，并且是EPCs的归巢信号。EPCs迁移能力可以被CXCR4中和抗体减弱。有研究提示SDF-1诱导EPC迁移可通过PI3K/Akt/eNOS信号传导通路介导。IL-6是一种多功能趋化因子，在生理条件下具有调节细胞增殖和分化的作用。IL-6有助于大脑EC和平滑肌细胞增殖迁移。同样，IL-6也以剂量依赖模式增强EPC增殖和迁移。EPCs表达IL-6受体（gp80和gp130），IL-6通过gp80和gp130及其下游ERK1/2和STAT-3磷酸化信号通路调节EPC增殖和迁移。

细胞迁移与细胞骨架密切相关。各种细胞活性，包括迁移、形态学改变和极性形成可被肌动蛋白纤丝分解、断裂和重组等动力学调节。在细胞迁移过程中，肌动蛋白纤丝在细胞主要边缘聚集至形成层形足板前突。在层形足板顶端，肌动蛋白单体结合至肌动蛋白纤丝毛刺末端，为细胞膜运动提供动力。这些过程可由一系列肌动蛋白结合蛋白调节。作为一种重要的肌动蛋白结合蛋白，人肌动蛋白素调节肌动蛋白纤丝聚集和分解，尤其在刺激诱导层形足板形成时。有研究者用蛋白质组学证实H2O2诱导EPCs迁移受损机制，提示肌动蛋白或/和人肌动蛋白素的氧化水平，而不是它的数量，与EPC迁移衰减能力相关。我们推测涉及EPCs迁移活化的调节器是肌动蛋白结合蛋白，该蛋白调节肌动蛋白纤丝，造成EPCs迁移至周围局部缺血或受损部位，然而其具体机制仍需要进一步研究。

4内皮祖细胞的粘附

很多数据均提示，在血管受损时动员于骨髓分化的CD34+祖细胞聚集在血管内膜并分化成ECs。EPCs从循环到新生血管形成部位的粘附，可能主要依赖于表达于EPCs上的P选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）和表达于血小板上的P选择素。血管损伤激活血小板，使其粘附于暴露的内皮下膜。依赖于这种粘附，活化的血小板表达P选择素并释放SDF-1，促进EPCs粘附到血管受损部位。SDF-1/CXCR4通路可能在SDF-1释放至受损部位微循环过程中发挥关键调节作用。SDF-1和CXCR4的相互作用上调PSGL-1在EPCs表面的表达，而PSGL-1是P选择素的主要受体，这种结合有助于EPCs粘附至血管受损部位，增强它们的促血管生成功能。EPCs归巢至局部缺血心肌膜的能力可因SDF-1/CXCR4通路抑制而受损，EPCs粘附至受损部位也可因CXCR4受阻而明显受抑。研究显示，在血管受损的30分钟后SDF-1高表达于聚集在血管受损部位的血小板上，然而在内皮受损的4小时后，SDF-1在SMC和聚集的血小板上均高表达。推测血小板可能是调节EPC向血管损伤部位粘附的短效SDF-1的主要来源。然而，SMCs在血管损伤后数日甚至数周仍释放长效SDF-1以维持血管修复和重组过程的主要细胞。结合素作为一种细胞粘附分子，通过与细胞间基质的相互作用调节细胞粘附和迁移。EPCs选择性表达β1和β2-结合素，强力粘附于损伤的内皮单层，有助于这些细胞归巢。通过坏死释放至细胞外基质的高迁移率族蛋白1（HMGB1）通过活化β1和β2-结合素也参与EPCs粘附至局部缺血部位。然而ECFCs不是造血祖细胞源的，相对于早期EPCs，它们不表达β2结合素，在特殊条件下这些细胞向局部缺血组织的归巢可能与E-选择素的表达相关。在EPCs向血管受损部位的重新募集中GPⅡb依赖性血小板聚集发挥关键作用。血小板和EPC之间通过GPⅡb形成链接，从而促进EPCs向血管部位归巢。另外，在PC获得捕获时由GPⅡb聚集的血小板可形成一个相关链条结构。另外，α4整联蛋白似乎参与了循环祖细胞归巢至新生血管形成部位并促进受损组织的血液灌注[2]。

5内皮祖细胞在新血管形成中的作用

EPC在新生血管形成中作用已经在动物模型和人体实验中得到证实。在局部缺血动物模型中，EPC的注入可明显增强缺血局部的新生血管形成，由此促进血流和受损组织恢复[3]。EPC植入在急性心肌梗塞患者中具有促进功能性恢复的作用[4，5]。这些研究提示EPC在新血管形成中具有重要作用。然而，这一理论仍有争议。这些争议可能源于缺乏明确的EPC筛选标准，以及对EPCs诱导血管形成的确切机制缺乏足够认识。EPC包含了不同细胞群，可能源于定向造血干细胞或内皮祖细胞。更多数据表明定向造血干细胞虽然促进了新血管形成，但却没有直接参与构成出生后血管形成的内膜内皮，而主要依赖体液和细胞介导的支撑功能[6]。相对的，晚生的内皮细胞在新生血管形成过程中可能结合并嵌入新生成血管，同时以一种旁分泌的模式释放促血管生成因子，虽然并没有直接的证据显示血管新生内膜形成是通过从EPC向成熟EC增殖和分化完成的。研究也显示EPC通过促进新血管形成成为损害修复的基本要素。在糖尿病中损伤修复延迟源于eNOS活性受损和由此导致的EPC从骨髓至外周循环动员障碍，这可能通过高氧症治疗而逆转。然而，由高氧症诱导的循环EPC水平增加却不能增强损伤治愈。一个可能的解释是在糖尿病患者中SDF-1产物在局部的损伤位置的下调相关。损伤中对SDF-1的调控可有效改善EPC迁移，增强新生血管形成和损伤修复，提示全面了解EPC介导新生血管形成的机制是必要的。这些尚不能解答的问题仍需进一步评估。

总之，EPCs在新血管形成中的作用可能为血管损伤性疾病提供潜在有效的治疗手段。然而，EPCs为非单一细胞群体，他们在新血管形成中的作用也是错综复杂的。EPCs介导的新血管形成是一复杂过程，包括EPCs从骨髓中动员进入血液循环，粘附并嵌入血管损伤部位，通过直接融合或间接旁分泌作用促进血管形成，大量细胞因子通过不同介质参与调节这一过程。因此，全面了解这一过程及机制可能为血管损伤疾病提供有价值的治疗策略。

参考文献：

[1]AsaharaT，MuroharaT，SullivanA，etal：Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis.Science275：964-967，1997.

[2]QinG，IiM，SilverM，WeckerA，BordE，MaH，etal：Functionaldisruptionofalpha4integrinmobilizesbonemarrowderivedendothelialprogenitorsandaugmentsischemicneovascularization.JExpMed203：153-163，2006.

[3]UrbichC，HeeschenC，AicherA，DernbachE，ZeiherAMandDimmelerS：Relevanceofmonocyticfeaturesforneovascularizationcapacityofcirculatingendothelialprogenitorcells.Circulation108：2511-2516，2003.

[4]AssmusB，SchächingerV，TeupeC，BrittenM，LehmannR，DöbertN，GrünwaldF，AicherA，UrbichC，MartinH，HoelzerD，DimmelerSandZeiherAM：Transplantationofprogenitorcellsandregenerationenhancementinacutemyocardialinfarction（TOPCARE-AMI）.Circulation106：3009-3017，2002.

[5]KovacicJC，MooreJ，HerbertA，MaD，BoehmMandGrahamRM：Endothelialprogenitorcells，angioblasts，andangiogenesis：oldtermsreconsideredfromacurrentperspective.TrendsCardiovascMed18：45-51，2008.

[6]HirschiKK，IngramDAandYoderMC：Assessingidentity，phenotype，andfateofendothelialprogenitorcells.ArteriosclerThrombVascBiol28：1584-1595，2008.