HPLC法测定银黄颗粒中绿原酸含量

王海鹰

摘要：目的：测定银黄颗粒剂中绿原酸的含量。方法采用高效液相色谱法，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10:90），流速：1.0mL/min，检测波长：327nm，进样体积：20μL。结果：银黄颗粒中的绿原酸所含的平均含量为0.31%。结论：经过测定银黄颗粒中绿原酸含量较高，该测定方法灵敏、结果准确、重现性好，可作为银黄颗粒质量标准的参考依据。

关键字：高效液相色谱法；银黄颗粒；绿原酸；含量测定

引言：

银黄颗粒是由金银花提取物、黄芩提取物加工制成的中药复方制剂，具有清热疏风、利咽解毒功效用于外感风热、肺胃热盛所致的咽干、咽痛、喉核肿大、口渴、发热。治疗急慢性扁桃体炎、急慢性咽喉炎、上呼吸道感染见上述症候者[1]。

金银花又名忍冬，在我国种植区域主要在山东、陕西、河南、河北、湖北、江西、广东等地。金银花性寒，味甘，入肺、心、胃经，属清热解毒之要药,有“中药之中的青霉素”之称。具有抗菌、抗病毒、增强免疫功能、抗炎解热、利胆保肝、降血脂、止血、抗氧化、抗生育等作用。金银花当中主要含挥发油、黄酮类、有机酸、三萜类及无机元素[2]。其中有机酸类的绿原酸类化合物为主要有效成分，药典规定绿原酸为金银花药材的指标成分,其含量不得少于1.5%[2]。

绿原酸类物质是植物体内有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类次生代谢产物，广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，杜仲、金银花、咖啡等植物中绿原酸类物质含量较高［3,4］。绿原酸类物质具有清除自由基、抗菌消炎、抑制肿瘤、保肝利胆、活血降压等生物活性，已成为天然产物研究领域的热点之一［5,6］。

高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

本文将采用高效液相色谱法测定银黄颗粒中绿原酸的含量。

正文：

1实验材料

1.1仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-20AT）、十万分之一电子分析天平（CPA225D）、超声仪、容量瓶和抽滤装置

1.2样品与试剂

银黄颗粒（本公司固体车间生产）、绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院）、乙腈（色谱纯，MerckKGaA）、磷酸（分析纯，广州化学试剂厂）、甲醇（色谱纯，MerckKGaA）

2试验方法

2.1色谱条件及系统适用性实验

检测波长：327nm

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂

流速：1.0mL/min

进样体积：20μL

流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10:90）

系统适用性：理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于2000

2.2溶液制备

2.2.1流动相配制

精密的量取3.6mL的磷酸置于烧杯中，加水稀释至900mL；再继续精密量取乙腈100mL，与上述溶液充分混匀，脱气，超声，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

取本品0.2g，研细，精密称定，置50mL棕色容量瓶中，加50%甲醇40mL，超声处理30min，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取绿原酸对照品约20mg，精密称定，置50mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3.0mL,置50mL容量瓶中加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3精密度试验

按2.1的色谱条件，取绿原酸对照品溶液分别进样5次，测得峰面积积分并计算相对偏差RSD。

2.4溶液稳定性试验

取本品适量，加50%甲醇溶解并稀释制成每lmL中含4.0mg的溶液，作为供试品溶液，室温放置，于配制后0、2、4、6、8小时精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.5重复性试验

精密称取样品，按含量测定法平行测定5份，考察该方法重复性。

2.6样品含量测定

分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

含量计算公式：

3结果与分析

3.1精密度分析

按2.1的色谱条件，取绿原酸对照品溶液20μL注入液相色谱，连续进样5次，记录色谱图，测定结果见表1，表明该法进样精密度良好。

3.2溶液稳定性分析

供试品配制：取供试品200.69mg，置于50mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释制成每lmL中含4.0mg的溶液，定容摇匀。作为供试品溶液，室温放置，于配制后0、2、4、6、8小时精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见表2。

3.3重复性分析

精密称取供试品五份，①200.69mg，②200.80mg，③201.05mg，④200.33mg，⑤200.44mg，分别置于50mL容量瓶中，加50%甲醇溶解，并定容摇匀，分别编号。

分别取20μL注入液相色谱，按含量测定法平行测定5份，考察该方法重复性。测定结果见表3，表明该法重复性好。

3.4回收率实验

取已知含量的样品细粉,精密称定于量瓶中,精密加入相应量绿原酸对照品，按上述色谱条件进行测定,结果见表4。

3.5样品含量测定结果

取本品批号为1501003、1501004、1501005、1501006、1501007、1501008，的六批样品，依次分别称取200.36mg、201.02mg、200.25mg、200.47mg、199.98mg、200.75mg，对照品分别称取20.25mg、20.72mg。照含量测定方法测定，结果见表5。

4结论

实验结果中，精密度实验测得峰面积积分制计算绿原酸的RSD=0.24%，结果表明该测定方法具有良好的精密度。

溶液稳定性实验绿原酸稳定性峰面积积分值RSD=0.22%，结果表明供试品溶液在8小时内稳定性良好。

重复性实验中绿原酸的含量RSD=0.31%，表明该法重现性良好。

回收率实验中绿原酸回收率99.01%，RSD=1.02%，表明该法准确性好。

含量测定实验中绿原酸的平均含量为0.368%。

应用HPLC法对银黄颗粒中的绿原酸含量进行测定，经方法学验证此方法简便易行且准确度、精密度等指标都符合要求。银黄颗粒质量标准的检测方法可依此作为参考。

参考文献：

〔1〕黄玮.HPLC法测定银黄颗粒中黄芩苷,黄芩素,绿原酸和咖啡酸的含量〔J〕.中国药师,2013(10):1516-1518

〔2〕滕红丽.金银花药材的综合研究分析〔J〕.中药材,2007,30(6):744-748

〔3〕MarquesV，FarahA．Chlorogenicacidsandrelatedcompoundsin

medicinalplantsandinfusions〔J〕．FoodChemistry，2009，113(4):1370-1376