LAMP技术在病毒检测中的应用

吴昊1孙立新2叶松1陆军1杨庆贵2

（1安徽理工大学医学院病原生物教研室安徽淮南232001）

（2江苏出入境检验检疫局医学媒介生物监测实验室江苏南京210001）

【摘要】LAMP（Loop-mediatedIsothermalAmplification）环介导等温扩增技术，是近年来新兴的分子生物学检测技术。因其特异性强、等温扩增，反应灵敏、操作简单、产物易检测，此项技术已被用于多种病原微生物的检测。本文综述了LAMP技术的原理以及其在几种常见病毒检测项目中的应用。

【关键词】LAMP技术原理病毒检测

【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）31-0064-02

病原微生物带来的卫生问题时常出现，各种检测手段也不断更新。但由于非特异性扩增、反应操作程序复杂、及仪器昂贵等问题，很多方法在疾病爆发时筛查现场和监测站点的应用受到限制。

LAMP技术是由日本学者Notomi等[1]在2000年开发的一种新型快速的扩增技术，它能在一定温度范围内，通过一个步骤在短时间内对目的片段进行大量有效扩增。其具有高特异性、高效性、快速、低成本、易检测、结果易观察等特点，被广泛用于各种病原体检测和研究中并取得了一定的成就。

1LAMP技术原理

1.1扩增机制

LAMP技术利用能够特异性识别靶序列上的6个独立区域的两对内、外引物，及具有链置换活性的BstDNA聚合酶启动循环链置换反应来进行靶序列的扩增[1]。反应中，先由外部引物将内部引物扩增所需要的模板扩增出来，然后由内部引物对靶基因片段进行引导合成。由于内部引物所扩增出的片段含有与该引物5’端DNA片段的反相互补序列，因此这些反相互补序列之间形成茎-环结构，同时，另外一条内部引物与也可形成茎-环结构，片段的两端形成哑铃状结构，如此循环往复的过程最后形成花椰菜形状的茎-环结构，可在15min-60min之内实现109-1010倍的括增[2]。

1.2结果观察

扩增后可以通过琼脂糖电泳后染色进行观察，更可通过扩增衍生物焦磷酸镁进行观察：阳性的样本会出现白色浑浊沉淀，而阴性则无此现象。同时也可以应用SYBRGreenI染色，呈现绿色的为阳性，橙色的为阴性[2]。

2病毒检测

2.1日本脑炎病毒

日本脑炎又称乙脑，是由日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)引起的一种常见的蚊媒传染病。JEV的检测方式很多，如血清学，病毒分离等，但耗时繁琐、敏感性特异性都较低。TORINIWA等[3]利用LAMP技术原理建立了快速Real-timeRT-LAMP方法，该方法通过扩增JEV病毒的包膜（E）蛋白基因来定量检测JEV病毒，可将检测用时缩短至1h，检测下限为1PFU并与常规RT-PCR具有相似的敏感性。且不需特殊设备、操作方便，有利于推广其在基层的应用。

2.2西尼罗河病毒

西尼罗河病毒（WestNileVirus，WNV）是引起西尼罗河热的病原体，近年来在世界部分地区的流行并造成了重大的损失。PARIDA等[4]创立了一种一步法来检测WNV，通过凝胶电泳或者浊度仪来对扩增结果进行判定。结果显示其敏感性比常规RT-PCR高10倍。

2.3甲型流感病毒

甲型流感病毒（AIV)具有高度传染性，致病性，以及致死率。对甲流病毒的检测方法主要为病毒分离，抗原和抗体检测以及PCR方法，但是过程费时繁琐。POON等[5]设计了特异性引物，利用LAMP技术成功的检测了H1-H3型的AIV，与PCR方法比较阳性符合率为100%，敏感度可达传统方法的100倍。LAMP技术由于其检测的简便快速且高度敏感，可更多的用于现场检测。

2.4禽流感病毒的检测

禽流感是由禽类A型流感病毒引起的一种急性、高接触性的传染病，可带来重大损失。禽流感检测方法有各类血清学试验以及免疫学实验等。这些方法都存在着如试验周期较长，操作繁琐，检测材料受限制等不足。国内李启明等[8]对H5N1亚型禽流感病毒进行了RT-LAMP检测，验证和分析后证明其特异性与常规方法一致，并且其灵敏度可达到10个拷贝。侯佳蕾等[6]根据H5亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计了引物，并建立了一种针对性的检测诊断方法。结果表明，该方法的灵敏度高于一步RT-PCR法。

2.5口蹄疫病毒的检测

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性，热性，高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽并给经济带来极大威胁。血清学检测不足以确定整群动物是否带毒而PCR方法由于需要专门的仪器。吴绍强等[7]以灭活的亚洲I型口蹄疫细胞培养病毒为材料，设计引物并建立了口蹄疫病毒RT-LAMP检测法，为口蹄疫现场快速检测提供了有效的方法。

2.6丙型肝炎病毒（HCV）的检测

HCV是一种常见的病毒，传播途径为母婴传播和血液传播。目前最常用的方法是ELLSA法检测抗原抗体或PCR法。但是由病毒的抗原量极少，所以常规免疫学方法常无法检测出病毒。PCR方法操作复杂繁琐，特异性较低。李启明等[8]利用LAMP技术的原理，利用特殊引物进行了LAMP扩增，成功的检测HCV基因，实验结果阳性符合率高达98%。这一成果证实了LAMP技术的优势。

2.7严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒（SARS-CoV）的检测

SARS带来的阴影提醒人们对此类病毒检测的重要性。目前临床上对其检测的方法主要有2种。一是检测SARS-CoV抗体，虽然此法灵敏度较高，但在发病初期不能检出。二是Real-timePCR，这种方法可在发病早期检测出SARS-CoV，但是其需要熟练操作技术以及高成本仪器，不适于常规筛查。POON等[9]利用改良LAMP法对人群的鼻咽分泌物样本进行了检测。结果显示SARS病人中的SARS-CoV检出率为64%，且随着病情的发展检出率进一步提高。HONG[10]等根据LAMP原理设计的方法对来自越南河内SARS流行期间的病人和健康人标本进行检测，结果证明RT-LAMP法的灵敏度是RT-PCR的100倍，且更加省时，经济简便。

2.8其他病毒的检测

LAMP技术还在诺瓦克病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、乙型肝炎病毒、小颗粒病毒、病毒性出血性、败血症病毒、伪狂犬病毒、尧新城疫病毒等的检测中得到了应用。

3结语

综上所述，LAMP技术是一种不需要特殊仪器设备且便捷灵敏而又快速的检测手段。能够在现场对样本进行快速准确的检测。但由于其易受污染导致假阳性，所以相关的技术以及体系需要进一步的优化和革新。相信LAMP技术会在不远的将来得到更加广泛的应用和更高的价值体现。

参考文献

[1]NotomiT,Okayama,MasubuchiH,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,2000,28(12):E63.

[2]IWAMOTOT,SONOBET,HAYASHIK.Loop-mediatedisothermalamplificationfordirectdetectionomycobacteriumtuberculosiscomplex,M.aviumandM.intracellulareinsputumsamples[J].JClinMicrobiol,2003,41(6):2616-2622.

[3]TORINIWAH,KOMIYAT.RapiddetectionandquantificationofJapaneseencephalitisvirusbyreal-timereversetranscriptionLoop-mediatedisothermalamplification[J].MicrobiolImmunol,2006,50(5):379-387.

[4]PARIDAM,POSADASG,INOUES,etal.Real-timereversetranscriptionLoop-mediatedisothermalamplificationforrapiddetectionofWestNilevirus[J].JClinMicrobiol,2004,42(1):257-263.

[5]PoonLIM,LeungCSW,ChanKH,etal.DetectionofhumaninfluenzaAvirusesbyLoop-mediatedisothermalamplification[J].JClinMicrobiol,2005,43（1）：427-430.

[6]侯佳蕾，罗开健，樊惠英等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立[J].中国兽医科学，2008，38（12）：1070-1074.

[7]吴绍强，林祥梅，刘建等.亚洲I型口蹄疫病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立[J].检验检疫科学，2008，18（1）：9-12.

[8]李启明，马学军，彭夫望等.环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）在丙型肝炎病毒基因检测中的应用[J].病毒学报，2006，22（5）：334-338.

[9]POONLL,LEUNGCS,TASHIROM,etal.Rapiddetectionofthesevereacuterespiratorysyndrome(SARS)coronavirusbyaLoop-mediatedisothermalamplificationassay[J].ClinChem,2004,50(6):1050-1052.

[10]HONGTC,MALQL,CHONGDV,etal.DevelopmentandevaluationofanovelLoop-mediatedisothermalamplificationmethodforsevereacuterespiratorysyndromeCoronavirus[J].JClinMicrobiol,2004,50(6):1050-1052.