局灶低温人工脑脊液冲洗治疗对脑外伤后脑水肿和血管内皮生长因子的影响

李创华１刘运生２刘宏伟２

【摘要】目的应用低温人工脑脊液对大鼠脑外伤伤灶局部冲洗治疗,检测脑组织中水含量和血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化,探讨人工脑脊液局灶冲洗对创伤性脑损伤的治疗作用及可能的脑保护机制.方法采用自由落体打击装置制备大鼠创伤性脑损伤模型,分正常对照组、外伤对照组、局灶人工脑脊液冲洗治疗组及局灶低温人工脑脊液冲洗治疗组.于伤后３０min开始分别以３７oC人工脑脊液及２５oC人工脑脊液进行局灶冲洗治疗,维持３h;伤后４h、１、３、５、７d处死留取脑组织标本,采用干湿重法测伤灶脑组织含水量,RT－PCR方法检测VEGFmRNA的表达.结果与外伤对照组相比,人工脑脊液治疗组伤灶脑组织水含量明显降低(p＜０．０５);脑外伤后４h伤灶脑组织中VEGFmRNA表达即明显上升,１d达到高峰,持续至３d,５d开始下降,７d降至正常水平;局灶冲洗治疗后,伤后４h、１d、３d和５d各组脑组织VEGFmRNA表达均低于外伤对照组相应各时间点(P＜０．０５);其中以局灶低温人工脑脊液冲洗治疗效果最佳.结论局灶低温人工脑脊液冲洗治疗能明显减轻伤灶脑水肿,有良好的治疗作用;调节VEGF的表达是其脑保护作用的机制之一.【关键词】局灶冲洗,脑损伤,脑水肿,血管内皮生长因子EffectofFocalIrrigationwithHypothermicArtificialCerebrospinalFluidonBrainEdemaandVEGFafterExperimentalTraumaticBrainInjuryLIChuang－hua,LIUYun－sheng,LIUHong－wei．(１DepartmentofNeurosurgery,TheBrainHospitalofHunan,Changsha,４１０００７．２DepartmentofNeurosurgery,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,４１０００８,China)【Abstract】Objective:Toinvestigatetheeffectoffocalirrigationwithhypothermicartificialcerebrospinalfluidonbrainedemaandtheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)followingtraumaticbraininjury(TBI)inrats．Method:RatswereunderwentseverelateralcontrolledcorticalimpactbraininjuＧry．ThirtyminutesafterTBI,focalirrigationtreatmentwasimplementwith３７oCor２５oCartificialcerebrospinalfluid,andmaintainedfor３hours．RatsweredeＧcapitated４h,１day,３days,５days,７daysafterinjury．Thepercentageofwaterintheinjuredparietalcerebralcortex,aswellasVEGFmRNAweremeasured．Result:InTBIrats,significantlyelevatedbrainedemawasdetectedat４h,１,３daysafterTBIintheinjuredparietalcerebralcortex,andbegantodeclineat５and７days．Thisriseinbrainedemawassignificantlyreducedwithposttraumaticfocalirrigation,especiallytreatedwithartificialcerebrospinalfluid．AfterTBI,theexpressionofVEGFmRNAweresignificantlyincreasedat４h,peakedat１~３d,andmaintainhighat５dcomparedwithNormalgroup(P＜０．０５)．TheexpressionofVEGFwassignificantlyreducedat４h,１d,３d,and５daftertreatedwithfocalirrigation,especiallytreatedwithhypothermicartificialcerebrospinalfluid．ConＧclusion:Focalirrigationwithhypothermicartificialcerebrospinalfluidcanreducetraumaticbrainedemasignificantly．ToregulatetheexpressionofVEGFmaybeoneofitsneuroprotectivemechanisms．【Keywords】:Focalirrigation;Artificialcerebrospinalfluid;Traumaticbraininjury;Brainedema;Vascularendothelialgrowthfactor【中图分类号】R４５４【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－１２２１－０２血管内皮生长因子具有促进血管生成,增加血管及血脑屏障通透性的作用,与脑水肿的形成有密切关系.在本课题组此前研究基础上,本文进一步研究人工脑脊液伤灶冲洗对脑外伤的治疗作用及其对血管内皮生长因子的影响,探讨其疗效及可能的脑保护机制.

１材料与方法

１．１动物分组与模型制作１．１．１实验动物分组成年SD大鼠１４０只,雌雄各半,体重２５０±５０克.将动物随机分入下列各组:正常对照组、外伤对照组、局灶人工脑脊液冲洗治疗组、局灶低温人工脑脊液冲洗治疗组;每治疗组按处死时间点分为４h、１、３、５、７d五个组,每组均为７只.１．１．２动物模型制作新鲜配制３％苯巴比妥钠溶液,１００mg/kg体重,腹腔注射麻醉.按照Freely法制备自由落体外伤模型:大鼠左侧顶部开一直径６mm骨窗,骨窗前缘距冠状缝１．５mm,内侧缘距中线２mm,保持硬膜完整,于硬膜外置直径４．５mm、高２．５mm打击垫,将重４０g的打击锤从２５cm高度自由落下制作急性重度颅脑外伤模型[１].于伤后３０min开始以３７oC或２５oC人工脑脊液进行伤灶局部冲洗治疗.冲洗装置为一自制胶管,胶管头端为一长４mm内径为６mm的胶管,后部连接一内径４mm的输液管.致伤后剪去伤灶硬脑膜,将胶管头端与伤灶骨窗连接,妥善固定,于胶管与骨窗接合处接一５号头皮针引流冲洗液;治疗时,分别采用３７oC和２５oC新配制经灭菌处理后的人工脑脊液,经输液管以５０mL/h的滴速进行冲洗,持续冲洗３小时.１．１．３人工脑脊液配方按Uchida等的配方[２]:Na＋１４５．５mol/L,K＋２．８mol/L,Ca２＋２．３mol/L,Mg２＋２．２mol/L,Cl－１２８．５mol/L,HCO３－２３．１mol/L,H２PO４－１．１mol/L,葡萄糖０．６１g/L,渗透压２８９．０mosM/L,PH值７．３１．２检测指标及方法１．２．１标本采集与处理分别在各预定时间点将大鼠快速断头处死取脑,在伤灶作冠状切开,前半部分用于脑水含量测定,后半部分用于VEGFmRNA测定.１．２．２脑组织水含量测定动物在规定时间断头处死后,迅速在脑挫裂伤灶边缘取脑组织,滤纸吸干表面水分,电子分析天枰称取湿重,然后放入电热恒温干燥箱中,１０５℃２４小时,两次称重误差小于０．２mg,取均值得其干重,按分式计算:脑组织水含量＝(湿重－干重)&pide;湿重×１００％.１．２．２脑组织VEGFmRNA测定采用逆转录聚合酶链反应法进行,使用Trizol试剂盒和逆转录聚合酶链反应试剂盒(MBI公司).电泳结果用凝胶图像分析系统进行电泳条带光密度分析,计算VEGF产物与β－actin产物的光密度积分的比值,作为VEGFmRNA表达的量化指标.

１．３统计学处理本文数据以均值±标准差(X±s)表示,采用SPSS１２．０统计软件进行方差分析.p＜０．０５表示有显著性差异.

２结果

２．１脑组织含水量正常对照组为正常脑组织,各时间点无差异;外伤对照组伤后４h脑组织含水量开始升高,１d达高峰,持续至３d,５d开始下降,７d进一步降低;除第７d组外,外伤后脑组织含水量均明显高于正常组,有显著性差异(p＞０．０５).经人工脑脊液治疗后,４h、１d、３d和５d组,脑组织含水量仍明显高于正常对照组各相应组,但均明显低于外伤对照组各相应组,均有显著性差异(p＞０．０５);但两治疗组的７d组与正常对照组、外伤对照组７d组相比,无显著性差异(p＞０．０５).局灶低温人工脑脊液治疗组的４h、１d、３d、５d和７d组脑组织含水量与局灶人工脑脊液治疗组相应各组相比均降低,除７d组外,其余各组均有显著性差异(p＜０．０５).如表１.

２．２脑组织中VEGFmRNA的表达正常对照组各时间段组脑组织中均可检测到低浓度VEGFmRNA的表达,但无显著性差异(p＞０．０５).外伤对照组中,伤后４h脑组织中VEGFmRNA的表达即开始增高,１d达到高峰,持续至３d,５d开始降低,７d仍有低浓度表达;１d与３d组脑组织中VEGFmRNA的表达无显著性差异(p＞０．０５),１d组与余各组间脑组织中VEGFmRNA的表达差异有显著性(p＜０．０５).与正常对照组比较,外伤对照组４h、１d、３d和５d组脑组织中VEGFmRNA的表达明显增高,差异有显著性(p＜０．０５);７d组脑组织中VEGFmRNA的表达与正常对照组无显著性差异(p＞０．０５).人工脑脊液治疗组中的４h、１d、３d和５d组,脑组织VEGFmRNA的表达仍明显高于正常对照组相应亚组,但均明显低于外伤对照组相应各组,均有显著性差异(p＜０．０５);两治疗组的７d组与正常对照组、外伤对照组７d组相比,无显著性差异(p＞０．０５).局灶低温人工脑脊液治疗组的４h、１d、３d、５d和７d组脑组织VEGFmRNA的表达与人工脑脊液治疗组相应各组相比均降低,除７d组外,其余各组均有显著性差异(p＜０．０５).如表２３讨论脑脊液对中枢神经系统有重要的保护与调节作用.由于软脑膜及室管膜的存在,脑脊液可以自由地与组织间液进行交换.脑外伤后,血液、坏死组织及炎性因子等物质释放到脑脊液中,对已受损的神经细胞非常不利,加重伤后脑组织水肿.本课题组已证实[１],对伤灶进行冲洗可以稀释脑脊液,减少血性脑脊液及炎性因子对脑组织的刺激,减轻创伤后继发性脑损伤.而且局灶的亚低温同样具有脑保护作用[２].我们认为,应用低温人工脑脊液进行脑外伤灶局灶冲洗,在治疗上可能取得双重疗效,即人工脑脊液冲联合亚低温治疗的效果,且操作方便.本实验结果显示,治疗组的脑组织含水量在伤后４h开始升高,１d达高峰,持续至３d,５d开始下降,７d恢复正常;在伤后４h、１d、３d和５d均明显低于外伤对照组,有显著性差异(p＞０．０５),两治疗组７d组与正常对照组及外伤对照组７d组比较,无显著性差异(p＞０．０５).人工脑脊液治疗组与局灶低温人工脑脊液治疗组相比,人工脑脊液治疗组４h、１d、３d和５d组的脑组织含水量均高于局灶低温人工脑脊液治疗组,差异有显著性(p＜０．０５);说明局灶低温人工脑脊液治疗疗效优于人工脑脊液治疗组.本实验证明,局灶低温冲洗治疗能明显减轻脑外伤后伤灶脑组织水肿.本实验结果还进一步显示,TBI组中,伤后４h脑组织中VEGFmRNA的表达即开始增高,１d达到高峰,持续至３d,５d开始降低,７d仍有低浓度表达;两治疗组中第４h、１d、３d和５d组脑组织中VEGFmRNA的表达均有不同程度下降,其中以局灶低温人工脑脊液冲洗治疗组明显,差异均有显著性(p＜０．０５).血管内皮因子(VEGF)具有促进血管内皮细胞生成,增加血管及血脑屏障通透性的作用,在缺血缺氧时表达增加.仇波等[３]证实脑外伤后小鼠海马VEGF表达明显升高,VEGF参与了小鼠脑外伤后的病理机制.许会彬[４]等研究发现颅脑损伤后血清VEGF水平升高,与伤情严重程度显著相关.Jin等[５]在全脑缺血的实验研究中发现,VEGF在４小时即表达增加,８－２４小时达高峰,７２小时仍高出正常水平.Nordal等[６]在脊髓的放射性损伤模型中,发现VEGF在照射后１６－２０周表达增加,主要在星形胶质细胞中表达,并且发生在白质坏死和前肢瘫痪之前;VEGF的表达与照射剂量呈正相关;在VEGF低表达小鼠模型,VEGF的低表达可延迟神经功能损伤的出现;照射后先血脑屏障开放,引起脑水肿、脑缺血缺氧,导致VEGF的表达,VEGF进一步使血管通透性增加,从而加重脑损伤;VEGF的低表达具有神经保护作用.本实验证实,局灶低温人工脑脊液冲洗治疗能明显抑制脑外伤后脑组织中VEGFmRNA的表达,其效果优于单纯人工脑脊液冲洗治疗.具有明显脑保护作用.

综上所述,局灶低温人工脑脊液冲洗治疗能有效减轻脑外伤后脑组织水肿,抑制VEGFmRNA的表达是其可能机制之一.本实验对将来脑外伤的临床及基础研究有重要意义.参考文献[１]李创华,刘运生,刘宏伟等．人工脑脊液冲洗治疗对实验性大鼠脑外伤后低氧诱导因子表达的影响[J]．脑与神经疾病杂志,２０１２,２０(３):２０６－２０９．[２]王光伟,刘运生,李创华等．重型颅脑外伤局灶低温与全身低温疗效的对比研究[J]．中国耳鼻喉颅底外科杂志[J],２００４,１０(４):１９３－１９５．[３]仇波,秦晓飞,王勇等．脑外伤小鼠海马血管内皮生长因子表达的变化[J]．解剖科学进展,２０１２,１８(２):１１９－１２１,１２５．[４]许会彬,王青,王化芬等．颅脑损伤患者血管内皮生长因子水平及其与预后的关系[J]．实用医药杂志,２０１３,３０(３):１９６－１９８．[５]JinKL,MaoXO,NagayamaT,etal．Inductionofvascularendothelialgrowthfactorandhypoxia－induciblefactor－１αbyglobalischemiainratbrain[J]．Neurosci．２０００,９９(３):５７７－５８５．[６]NordalRA,NagyA,PintilieM,etal．Hypoxiaandhypoxia－induciblefactor－１targetgenesincentralnervoussystemradiationinjury:aroleforvascularendothelialgrowthfactor[J]．ClinCancerRes,２００４,１０(５):３３４２－３３５３．