胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞的体外耐药性研究

汪传一

(河南省洛阳市东方医院普外二病区471000)

【摘要】目的：探讨胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞的体外耐药性。方法：经胰腺癌肿瘤干细胞表面标记途径和侧群(SP)细胞途径，分离人胰腺癌细胞株PANC-1内SP/NSP(非SP)细胞、CD44+CD24+/CD44-CD24-细胞亚群，采取MTT方法检测亚群细胞体外化疗药物耐受性，经实时荧光定量PCR检测耐药基因ABCG2、ABCB1和PLK-1表达情况。结果：人胰腺癌细胞株PANC-1内SP细胞构成比为(7.58±0.54)%，CD44+CD24+细胞构成比(2.58±0.85)%；SP、CD44+CD24+细胞化疗耐受性更强、抗凋亡效果更为明显；经荧光定量RT-PCR表明，SP、CD44+CD24+细胞耐药基因ABCG2、ABCB1和PLK1具有较高表达。结论：人胰腺癌细胞株PANC-1内SP及CD44+CD24+细胞存在明显化疗耐受性。

【关键词】胰腺癌PANC-1肿瘤干细胞耐药性

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）19-0251-02

胰腺癌属于临床中恶性消化道肿瘤，患者5年生存率低于5%，中位生存期4-6个月。胰腺癌对放化疗并不具有较高敏感性，当前胰腺癌一线化疗药物吉西他滨可以缓解患者疼痛和降低体重减轻等，但无改变胰腺癌治疗状况[1]。本文对胰腺癌细胞株PANC-1中肿瘤干细胞的体外耐药性进行分析，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

本文选取合适人胰腺癌细胞株PANC-1，并应用适宜DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、吉西他滨、TrizolReagent试剂盒、AMV反转录试剂盒、低速离心机、二氧化碳细胞培养箱等。

1.2方法

取对数生长期的PANC-1细胞，进行SP细胞检测和分选，CD44+CD24+细胞分选，将所分选SP细胞、NSP细胞、CD44+CD24+、CD44-CD24-细胞分别接种到96孔板，每孔细胞1×104个(200μL)，培养持续12h加进梯度浓度吉西他滨，浓度梯度分别是0.1、0.33、1、3.3、10、33、100μmol/L，每浓度组设立4个复孔，另取对照组(不加药)及空白对照组(培养基加MTT加二甲基亚砜)[2]。经细胞培养箱持续培养72h，每孔加入5g/LMTT20μL，然后经4h培养,除去上清液，每孔加入DMSO150μL，经避光震荡连续10min，应用全自动酶标仪读板，波长490nm。重复试验3次，计算IC50。将AnnexinV加入PI双染检测细胞凋亡情况，荧光定量RT-PCR检测基因表达。

2结果

经SP细胞检测，人胰腺癌细胞株PANC-1中SP细胞比例为(7.58±0.54)%(n=8)，维拉帕米拮抗后SP构成比降低，接近零或完全达到零。可建立通道R1、R2分别采集SP细胞、NSP细胞。经流式细胞仪检测，PANC-1细胞内CD44+CD24+细胞构成比为(2.58±0.85)%。计算各细胞亚群IC50，SP细胞(20.68±1.46μmol/L)相比较NSP(3.93±0.85μmol/L)显著上升；CD44+CD24+(12.45±0.42μmol/L)相比较CD44-CD24-(3.85±0.64μmol/L)显著增加，差异均有统计学意义(P﹤0.05)。经流式细胞仪检测细胞凋亡情况表明，1、

10μmol/L吉西他滨持续发挥72h作用后，比较NSP和CD44-CD24-，SP、CD44+CD24+细胞对于吉西他滨所引发细胞凋亡更具有耐受，各细胞亚群凋亡率如表1所示。

表1各个细胞亚群不同浓度凋亡率对比

药物浓度(μmol/L)SPNSPCD44+CD24+CD44-CD24-

111.35±0.8513.485±0.9514.525±1.2613.975±1.58

1013.215±1.5464.255±2.6423.495±3.1670.595±2.16

经荧光定量PCR检测基因表达，以2–ΔΔCT(Livak)法处理实验数据，SP细胞内ABCB1、ABCG2、PLK1表达量分别为NSP内(6.26±0.28)倍、(3.36±0.92)倍、(4.14±0.28)倍，CD44+CD24+亚群细胞基因表达量分别是CD44-CD24-细胞的(3.51±0.38)倍、(4.60±0.35)倍和(6.20±0.64)倍。

3讨论

经肿瘤干细胞理论研究发现，肿瘤为异质型细胞群所组成，其中肿瘤干细胞存在自我更新效果，并产生异质型肿瘤细胞，而此亚群细胞能够形成肿瘤。而且此亚群细胞属于肿瘤出现转移、化疗耐受性、复发的主导因素。经本文研究显示，应用SP细胞途径及胰腺癌肿瘤干细胞表面标记CD44、CD24由人胰腺癌PANC-1细胞系内分离选择SP细胞、CD44+CD24+细胞亚群，经体外不同浓度吉西他滨效果，通过MTT法绘制药物抑制率，可以得到不同亚群细胞的IC50[3]。相比较NSP和CD44-CD24-细胞，SP、CD44+CD24+细胞存在更为明显化疗耐受性。进Aennix-Ⅴ、PI双染，以流式细胞仪测定不同浓度吉西他滨对各个细胞亚群凋亡、死亡率效果，显示同样浓度下吉西他滨发挥作用，SP、D44+CD24+细胞亚群存在更为显著抗凋亡作用[4]。总之，人胰腺癌PANC-1细胞株内，并非全部细胞均存在相同化疗耐受性，经SP表型和特异性CD分子选择出胰腺癌干细胞样细胞所存在化疗耐受性更为明显。肿瘤干细胞学说对用户研究胰腺癌化疗耐受性提供更为新型视角及理论依据。将肿瘤干细胞作为靶向进行治疗，可以有效克服胰腺癌化疗作用差的情况。

参考文献

[1]吴菲.ATPR对ECA-109、PANC-1、HeLa细胞增殖及分化的影响[J].中国癌症杂志，2012，22(4)：257

[2]周竹超.Notch2表达与胰腺癌干细胞相关[J].肿瘤，2011，31(8)：707

[3]刘国忠.索拉菲尼、PDTC联用对胰腺癌细胞株PANC-1的作用研究[J].中国癌症杂志，2013，23(6)：425

[4]胡海.胰腺癌干细胞研究进展[J].肿瘤防治研究，2013，40(8):801