芹菜素对糖尿病模型小鼠氧化应激和单核细胞趋化蛋白-1的影响

杨超月

【摘要】目的：研究芹菜素(apigenin,AP)对糖尿病模型小鼠氧化应激和单核细胞趋化蛋白-1的影响，并初步探讨其降血糖的作用机制。方法：复制链脲佐菌素(STZ)致糖尿病小鼠模型。将50只昆明鼠随机分为5组，分别是正常对照组、模型组、AP低(5mg·kg-1)、中(10mg·kg-1)和高(20mg·kg-1)剂量治疗组，治疗组每日腹腔注射给药，连续30d。采用血糖仪检测空腹血糖；ELISA法检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；RT-PCR法检测胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达。结果：AP可显著降低糖尿病模型小鼠血糖，提高SOD活性，减少MDA含量，抑制胰腺MCP-1mRNA表达(P<0.05,P<0.01)，并具有药物剂量依赖性。结论：AP对STZ引起的高血糖有很好的降血糖作用，其作用机制可能与其降低氧化应激水平和抑制MCP-1的表达相关。

【关键词】芹菜素;糖尿病;氧化应激;超氧化物歧化酶;丙二醛;单核细胞趋化蛋白-1

TheEffectofApigeninonOxidativeStressandMonocyteChemoattractantProtein1inDiabeticMice

YangChaoYue

【Abstract】Objectiv:Tostudytheeffectofapigeninonoxidativestressandmonocytechemoattractantprotein1indiabeticmice,andexploreitsmechanismofhypoglycemosis.METHODS:Ddiabeticmicemodelwasestablishedbystreptozotocin(STZ).Fiftykunmingmicewerepidedintofivegroupsrandomly,includingnormalcontrolgroup,modelcontrolgroup,APlowdose(5mg·kg-1)treatmentgroup,APmiddledose(10mg·kg-1)treatmentgroupandAPhighdose(20mg·kg-1)treatmentgroup.TheAPtreatmentgroupswereadministratedAPi.p.dailyforthirtydayscontinuously.Fastingbloodglucosewastestedbyglucosemeter;theactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andthelevelofmalondialdehyde(MDA)inbloodserumweretestedbyELISA;theexpressionofmonocytechemoattractantprotein1(MCP-1)mRNAinpancreaswastestedbyRT-PCR.RESULTS:APcandecreasethecontentofbloodglucose,increasetheactivityofSOD,lowerthelevelofMDA,inhibittheexpressionofMCP-1mRNAinadose-dependentmannerindiabeticmiceinducedbySTZsignificantly(P<0.05,P<0.01).CONCLUSION:APhasagoodhypoglycemiceffectondiabeticmiceinducedbySTZ,anditsmechanismmayberelatedtolowerthelevelofoxidativestressandinhibittheexpressionofMCP-1.

【Keywords】Apigenin;diabetes;oxidativestress;superoxidedismutase(SOD);malondialdehyde(MDA);chemoattractantprotein1(MCP-1)

【中图分类号】R141【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)06-0030-02

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，其确切的病因和发病机制尚未完全阐明[1]。目前的研究认为，糖尿病的发生发展与自由基介导的机体氧化损伤和抗氧化防御系统清除自由基能力的平衡失调密切相关[2]。糖尿病又可以被看作是一种炎症性疾病，即氧化应激反应中蕴含着炎症反应[3]。以上关于糖尿病发病机制认识的突破性进展为糖尿病治疗提供了新的思路。芹菜素(apigenin,AP)是一种黄酮类化合物，具有降血压、抗炎、抗肿瘤、抗氧化和清除自由基等作用[4]。目前，AP广泛应用于肿瘤治疗的研究中，具有抑制和治疗多种肿瘤的潜能[5,6]，而在其它疾病中的应用少有研究。本研究采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病模型小鼠，观察芹菜素对糖尿病小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响，探讨其对糖尿病模型小鼠降血糖的治疗机理。

1仪器与材料

1.1仪器:680型酶标仪和PowerPacBasic型电泳仪(美国Bio-RAD公司)；MG48G型基因扩增仪（杭州朗基）；Megafuge1.0R型低温离心机（德国Herculeus公司）；优越型血糖仪（德国罗氏）；BIO-PRO凝胶成像分析系统（美国西盟(SIM)公司）。

1.2试药:芹菜素(AP)和链脲佐菌素(STZ)（美国Sigma公司）；小鼠丙二醛(MDA)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(货号：GS-E20347)和小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(货号：GS-E20348)（上海工硕生物技术有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；100bpDNAmarker和PCRTaq（大连宝生物工程有限公司）；revertaidfirststrandcDNAsynthesiskit（MBIfermentas公司）；PCR引物由上海英俊生物技术有限公司合成；其它试剂为国产分析纯试剂。

1.3动物:昆明小鼠，体重22~25g，由广西医科大学实验动物中心提供，试验动物生产许可证：SCXK(桂)2003-0003。

2方法

2.1糖尿病模型小鼠制备[7]:小鼠禁食自由饮水12h后，按150mg·kg-1剂量一次性腹腔注射STZ(用0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液新鲜配制成15mg·mL-1溶液，现配现用，冰浴保存)。注射后的小鼠自由饮水、进食标准饲料。3d后动物禁食，自由饮水12h，采取尾静脉血测定小鼠全血血糖值，空腹血糖值均在大于11.1mmol·L-1的小鼠为糖尿病模型小鼠。

2.2实验动物分组及治疗措施:实验分为正常对照组、糖尿病模型组、AP治疗组（分为低剂量组(5mg·kg-1)、中剂量组(10mg·kg-1)和高剂量组(20mg·kg-1)），每组各10只小鼠。每天上午禁食2h后腹腔注射给药：AP治疗组分别按5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1体质量给药，糖尿病模型组和正常对照组腹腔注射等容量蒸馏水，连续给药30d。

2.3血糖测定:于开始给药后30d20:00p.m.禁食12h（不禁水），次日8:00a.m.断尾法取血（肝素抗凝）测定空腹血糖。血糖测定采用德国罗氏优越型血糖仪，具体操作严格按照仪器使用说明。

2.4血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性检测:与“2.3”同步眼球取血（非肝素抗凝），室温静止1h，离心(3000r·min-1,5min)，获取血清，按ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行操作。即待测样品50L与50L的生物素标记的抗体于反应孔内混匀，37℃温育1h，洗涤；加入80L亲和链酶素-HRP，混匀，37℃温育30min，洗涤；加入底物A和B各50L，混匀，37℃温育10min；加入50L终止液，立即用酶标仪在波长450nm测定各孔的吸光度A值。并同步做标准曲线，样品中MDA和SOD含量根据其A值由标准曲线换算出相应的浓度。

2.5胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA检测:与“2.3”同步获取胰腺，按Trizol试剂说明提取胰腺总mRNA。使用一步法RT-PCR，逆转录合成cDNA后进行PCR扩增MCP-1基因。逆转录反应条件：65℃5min；42℃1h；72℃5min。PCR扩增条件：94℃3min后进行30个循环扩增(94℃30s；55℃40s;72℃30s)；72℃10min，以β-actin为内参照。小鼠MCP-1基因序列的上游引物为5′ACCCTTACACACATCAGCA3′，下游引物为5′CTACCATCAGCACAACAAAGA3′，产物大小为447bp；β-actin上游引物为5′GTAAAGACCTCTATGCCAACAC3′，下游引物为5′CTAGGAGCCAGAGCAGTAATC3′，产物大小为100bp。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶(含1mg·L-1EB)电泳，电泳结果采用凝胶成像分析系统成像，并通过quantityone软件计算MCP-1与β-actin条带灰度比值，以表示样本中MCP-1相对mRNA水平。

2.6统计学方法:数据用SPSS10.0软件分析，以均数±标准差(X±s)表示，n为例数，多组间比较用one-wayANOVA，两组间比较用非配对Student'st-test，P<0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1AP对糖尿病小鼠血糖的影响:模型对照组小鼠在建模后30d，空腹血糖值为21.76±1.39mmol·L-1，明显高于正常对照组(P<0.01)。经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，与模型对照组相比，血糖显著下降(P<0.05和P<0.01)，具有药物剂量依赖性。其中，以20mg·kg-1AP连续给药30d，血糖下降幅度最大，其血糖值为8.35±0.52mmol·L-1，属于正常范围(≤11.1mmol·L-1)。AP对糖尿病小鼠血糖影响见表1。

#与正常对照组比较:*P<0.01；与模型对照组比较:**P<0.05；与模型对照组比较:#P<0.01

3.2AP对糖尿病小鼠MDA含量和SOD活性的影响:将一系列不同浓度的标准品与测定的对应A值作标准曲线,并进行直线相关回归分析,得出MDA直线回归方程为Y=0.04+0.009X,r=0.997；SOD直线回归方程为Y=0.02+0.01X,r=0.998（浓度为横坐标(X)，A值为纵坐标(Y)）。将样品测得的A值代入相应的直线回归方程中,即得到相应的含量。模型对照组小鼠在建模后30d，与正常对照组相比，血清中MDA含量明显升高，而SOD活性明显下降(P<0.01)，分别为29.31±1.07nmol·mL-1和35.78±1.17IU·mL-1。经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，与模型对照组相比，MDA含量显著下降，而SOD活性显著上升(P<0.05和P<0.01)，并具有药物剂量依赖性。AP对糖尿病小鼠MDA含量和SOD活性的影响见表2。

3.3AP对糖尿病小鼠胰腺MCP-1mRNA表达的影响:正常对照组小鼠胰腺MCP-1在mRNA水平上检测不到其表达，而模型对照组小鼠在建模后30d，胰腺MCP-1mRNA的表达显著上升(P<0.01)，其DNA条带灰度比值为2.68±0.24。经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，与模型对照组相比，MCP-1DNA条带灰度比值显著下降，即MCP-1mRNA的表达显著下降(P<0.01)，并具有药物剂量依赖性。AP对糖尿病小鼠胰腺MCP-1mRNA表达的影响见图1和表3。

1:正常对照组;2:模型对照组;3:AP低剂量组(5mg·kg-1);4:AP中剂量组(10mg·kg-1);5:AP高剂量组(20mg·kg-1);6:DNAmarker

4讨论

本研究通过腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)，诱发出高血糖症，成功复制出糖尿病模型。连续30d腹腔注射芹菜素(AP)，发现糖尿病模型小鼠的血糖显著下降(P<0.01)，并以注射20mg·kg-1AP为佳。这提示AP具有很好的降血糖作用。

目前的研究发现，氧化应激参与糖尿病及其并发症的发生和发展。氧化应激的增强可增加自由基产生和抑制自由基防御系统，直接损伤胰岛β细胞，甚至影响胰岛素合成和分泌的信号转导通路，间接损伤胰岛β细胞[2]。超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶类，其活力能够反映机体的抗氧化水平；丙二醛(MDA)是最常见的脂质过氧化产物，其含量可以衡量脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞受损伤程度[8]。本研究结果显示，STZ诱发的糖尿病小鼠血清中MDA含量显著高于正常小鼠(P<0.01)，但血清中SOD活力显著降低(P<0.01)，总抗氧化能力降低，表明高血糖时存在自由基产生增加和抗氧化能力减弱。经5mg·kg-1、10mg·kg-1和20mg·kg-1AP治疗30d后，血清MDA含量逐渐下降，SOD活力逐渐上升(P<0.05,P<0.01)，且具有一定量效关系。说明AP具有降低糖尿病小鼠体内氧化应激反应，清除自由基，增强机体抗氧化防御能力，调节和改善自由基代谢的作用。这可能是AP降低糖尿病小鼠血糖的机制之一。

单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)属于趋化细胞因子超家族中β家系成员之一，由体内多种细胞产生，可趋化激活单核巨噬细胞向炎症部位聚集，参与炎症反应[9]。目前研究发现，氧化应激可以上调MCP-1的表达，其表达能促进糖尿病肾进行性损伤和纤维化等糖尿病并发症[10]。本研究结果显示，STZ诱发的糖尿病模型小鼠胰腺MCP-1mRNA的表达显著上升(P<0.01)，并与高氧化应激反应和高血糖并存。当给予糖尿病小鼠腹腔注射AP后，胰腺MCP-1mRNA的表达显著下降(P<0.01)，下降趋势与氧化应激反应和血糖一致，并具有药物剂量依赖性。这说明AP具有抑制胰腺MCP-1的表达，抑制单核巨噬细胞向胰腺浸润，抑制胰腺的炎症反应，从而下降糖尿病模型小鼠血糖。

本研究发现，AP可能通过抑制糖尿病模型小鼠体内氧化应激反应和炎症因子MCP-1的表达，从而降低其血糖，对糖尿病模型小鼠具有很好的治疗效果，但其具体机制有待进一步的研究。

参考文献

[1]IngerskiLM,AndersonBJ,DolanLM,etal.Bloodglucosemonitoringandglycemiccontrolinadolescence:contributionofdiabetes-specificresponsibilityandfamilyconflict[J].escHealth,2010,47(2):191

[2]RashidiA,NakhjavaniM,EsteghamatiA,etal.Associationbetweenoxidant/antioxidantmarkersandproteinuriaintype2diabetes:resultsin142patients[J].JAdolJNephrol,2009,22(6):733

[3]CelikS,ErdoganS.Caffeicacidphenethylester(CAPE)protectsbrainagainstoxidativestressandinflammationinducedbydiabetesinrats[J].MolCellBiochem,2008,312(1-2):39

[4]VargoMA,VossOH,PoustkaF,etal.Apigenin-induced-apoptosisismediatedbytheactivationofPKCdeltaandcaspasesinleukemiacells[J].BiochemPharmacol,2006,72(6):681

[5]ShuklaS,GuptaS.Apigenin:apromisingmoleculeforcancerprevention[J].PharmRes.2010,27(6):962

[6]LuHF,ChieYJ,YangMS,etal.Apigenininducescaspase-dependentapoptosisinhumanlungcancerA549cellsthroughBax-andBcl-2-triggeredmitochondrialpathway[J].IntJOncol.2010,36(6):1477

[7]黄桂红,马杰津,贺敏等.杨桃根醇提物对糖尿病模型小鼠的血糖及抗氧化能力的影响研究[J].中国药房,2009,20(24):1849-1850

[8]谢展雄,吴建伟,吴铁松等.吡拉西坦对D-半乳糖致衰老模型大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影响[J].中国药房,2009,20(19):1459

[9]YasuiT,UemuraH,HyodoS,etal.Raloxifenereducescirculatinglevelsofinterleukin-7andmonocytechemoattractantprotein-1inpostmenopausalwomen[J].Atherosclerosis,2009,204(2):471

[10]CheungGT,SiowYL,OK.Homocysteinestimulatesmonocytechemoattractantprotein-1expressioninmesangialcellsviaNF-kappaBactivation[J].CanJPhysiolPharmacol,2008,86(3):88

作者单位：421002湖南省衡阳市第一人民医院